角膜上皮组织工程学研究及临床应用新进展

王威 张红 刘平

角膜组织工程学是现代角膜疾病基础学研究的重要方法之一，角膜上皮细胞的体外培养更是研究角膜的生理学、病理学、免疫学、分子生物学以及临床应用极为重要的手段。现将近年来国内外角膜上皮细胞组织工程学发展现状及其在眼科临床应用中的进展作一综述。

1 角膜上皮的构建

1.1 种子细胞的选择 角膜上皮具有自我更新的能力，它是由位于角膜缘的干细胞增殖分化而来的。1986年Schermer等最先实验证明角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底层的Vogt栅栏处;Tsubota等最早行异体角膜移植术;Pellegrini等［1］首次通过体外扩增角膜缘干细胞进行眼表重建，成为角膜缘干细胞移植发展史上的里程碑。在穿透性角膜移植的同期或分期联合施行角膜缘干细胞移植是目前最理想的移植术，尤其适合于角膜缘干细胞严重缺乏的病例。它弥补了当前角膜移植术只能取代混浊的角膜基质或失代偿的角膜内皮，不能迅速上皮化，不能阻止新生血管侵入、排斥反应重、手术失败率高的缺陷。因其在培养过程中所需角膜缘组织极少，对供眼无潜在威胁;培养的细胞可冻存，可用于二次手术;能抑制眼表急性病变发展，迅速恢复术眼正常的眼表结构;免疫原性低，符合人的自身发展状况，成为角膜上皮组织工程重建中最理想的种子细胞。目前研究中争论的焦点主要集中在角膜缘干细胞的特异标记物还不能明确［2］，没办法阐明角膜缘干细胞怎样进行分裂及定位，在临床试验中不能大量提纯与增殖等。因此国内外学者不断尝试开发各种细胞、组织，通过各种方法经体外诱导分化为种子资源，在解决种子细胞来源匮乏及移植排斥问题上显示了诱人的前景。如取自周围血、脐带血、骨髓中的干细胞［3］;来源于早期胚胎原始生殖嵴具有无限增殖能力的胚胎干细胞［4-5］及胚胎皮肤干细胞［6］;发育同源性的口腔黏膜皮肤上皮细胞［7-9］;另外还有结膜干细胞［10］、间质干细胞［11-12］、牙髓干细胞［13］、毛囊干细胞［14］等，它们或因取材方便，或因体外增殖能力强，或因能表达角膜特异性标记物等吸引眼科学者不断进行探索，但也因机械性能差，不能逾越的安全性、伦理性问题，以及仅能形成类角膜上皮样组织等方面的不足而不能在临床工作中大量开展应用。

1.2 支架材料选择 当前组织工程中的生物材料仍以天然材料、人工合成材料、复合材料为主。羊膜在眼科应用的最早、范围最广，现在已经能根据不同需要制备不同的羊膜，通过不断的改进，已能克服制备不标准，细胞生长缓慢、不均匀、易脱落，易感染HIV、肝炎，体外培养易发生“去分化”等缺点［15］。胶原是天然细胞外基质的重要组成部分，通过交联、非醛交联及应用溶酶体酶技术对胶原进行改进，控制其密度、交联方式、孔隙率，改善降解速率，加强其强度与韧性，是支架材料很好的选择之一［16］;除去了脂质膜、膜相关抗原和可溶性蛋白质的脱细胞角膜基质，免疫原性更低，同时又保持了天然角膜板层纤维结构、韧性、厚度的特点，其超微环境更适于细胞再生与三维重建，还能使不可利用的基质得到重新应用;纤维凝胶是细胞外基质的多功能成分，具有可以从人及牛血液中制备，提取更方便，来源更丰富［17］的优点;生物蛋白膜蚕丝蛋白的应用是目前研究开发的热点［18］;改进人工支架材料聚乳酸、多聚已酸［19-20］的代谢及渗透压等都是目前聚焦的研究方向。各种生物材料在介导细胞附着、生长，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，联合生物活性分子及生长因子，保留天然高分子聚合物，表达二维和三维空间结构，改善代谢及渗透压，降低细胞毒性，操作方便等方面都有不断的突破与改进，但它们也有各自不同的缺点及不足。2004年，Nishida等［9］利用简单的温度变化，在无胰酶消化的情况下使细胞膜片脱落，培养的角膜上皮细胞免疫组织学检测及免疫印迹检测显示角膜上皮样特征，细胞间连接与膜片透明性良好。收获的细胞膜片易于移植操作，与角膜基质黏附紧密，无需缝合。并且易对密度、厚度、添加成分等进行掌控，影响细胞的黏附与增殖。避免了传统组织工程中使用胰酶消化或机械刮取对培养角膜细胞完整性的破坏及载体材料对组织修复的影响，此即无载体培养。这为组织工程支架材料的应用带来了新的应用前景。总之，支架材料无毒副作用、组织相容性好、生物可降解性佳，具有一定的机械强度，是组织工程支架材料的研究方向。

2 微环境的调控

干细胞微环境学说最先由Schofield提出，学说假设基底部Vogt栅栏内的乳头状结构深入到基底深层，与血管网接触，吸收营养［21］;基质细胞中分泌多种细胞因子和生长因子，诱发人类组织相容性D抗原辅助T淋巴细胞反应(HLA-D/Th)［21］，使干细胞在机体特殊的内环境作用下保持未分化或分化状态动态平衡，调节细胞的有丝分裂与凋亡，促进上皮细胞分化与迁移，延长干细胞的存活寿命。体外研究表明很多细胞因子及生长因子都能上调干细胞的增殖、迁移与分化、促进p63高表达，如肿瘤生长因子(TGF)、白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、增益因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)［22］等。因此基因治疗应运而生，即通过特定的分子生物学技术关闭或降低异常基因的表达或将正常的外源基因导入体内特定的靶细胞以弥补缺陷基因，或将某种特定基因导入体细胞内，反义寡核苷酸阻断RNA的转录等以产生特定的蛋白质因子表达，从而实现对疾病的治疗作用，使细胞进入不同的形态或未分化状态［23］，调节干细胞的增殖，促进上皮细胞化。

3 培养方法

角膜上皮细胞体外培养方法中，细胞悬液法能裂解信号，诱导干细胞表达更多角蛋白K3和K12，似乎更适于细胞生长，但尚无完整的统计学资料进行证明。以往在组织培养过程中常添加各种成分，如3T3鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)、胎牛血清、小牛血清等，在促进细胞增殖的同时，也增加了感染与污染的危险。采用无血清、气液平面培养，尽量模拟体内生长环境，同时在组织工程制备过程中要求具有“干净”的实验室，优良、规范化的制作程序，临床实验要求符合法国管理条约(AFSSaPS)和法国健康组织与欧盟指导原则。试验方法要遵照赫尔辛基宣言与人类组织国际道德伦理规范。终极目标是减少成纤维污染，保护干细胞在培养过程中的生存环境，以确保患者在治疗过程中的安全性及临床试验与实验研究可靠性。

4 术后防治措施

免疫抑制剂在异体角膜移植甚至在自体角膜移植中的应用都有很成熟的报道［24］，临床术后常单独或联合应用的免疫抑制剂有:环胞霉素、环磷酰胺、糖皮质激素［25］，应用后9个月就很难在上皮中找到DNA、HLA-DR抗原和淋巴细胞。术后并发的炎症、渗出、穿孔、青光眼等常与细胞培养方式过程中的许多复杂而未知的因素有关。因此术后采用一系列防护措施，如绷带式接触镜、眼睑缝合、羊膜缝合等技术能促进角膜上皮化，提高手术成功率，减少角膜上皮的溶解与排斥。以往临床普遍采用术后6个月的随访时间，但完全角膜上皮化需要9～12个月的时间，移植失败一般发生在2 a左右，因此采用24个月术后随访时间更合理，以便能更好地评估细胞治疗的安全性与有效性。HLA基因配型可以从根本上防治异体移植排斥反应的发生。随着科学技术的发展、基因敲除技术的完善，移植免疫排斥的问题将会被彻底解决。

5 眼表评估

因为不同的研究者采用不同培养方法及实验过程进行研究，样本采集数量等也不同，导致评价指标及结果有很大差异，从而影响结果的分析与判断。在严重的眼表疾病，常伴有结膜与眼睑的病理学改变，术前要给予恰当而准确的评估，对选择不同的治疗方案，估计预后及指导临床治疗具有重要意义。目前国际上公认应在术前应用印迹细胞学、共聚焦显微镜、荧光染色、照片法及裂隙灯等方法，以最小的侵袭力对眼附属器如眼睑、睫毛、结膜、泪膜、穹隆深度、角膜瘢痕、新生血管、干眼症等方面进行评估。并给予如板层角膜移植、结膜移植等恰当的术前治疗以增加术后成功率。手术后仅单纯采用视敏度进行评估，由于主观原因使评估结果可靠度差，采用Snellen评分，术后大约能提高＞2 Snellen视敏度。并用X+Y=Z方程式来评价细胞生成与丢失的关系(X代表基底细胞向角膜中央迁徙，Y代表周围细胞向中央迁徙，Z代表剥脱的角膜上皮)［25］及细胞生长曲线都是对角膜细胞生长有效的评估。问卷调查患者的生活质量也应被考虑在术后评估的范畴内。据报道在体外培养的角膜缘干细胞中如有3%的p63染色阳性，临床就能使接受移植的患者达到78%的成功率［26］。这也说明移植成功的关键取决于干细胞在培养过程中的充足性。目前完整的评价标准还是很难达到统一。但在一些西欧国家，是由人类组织权利机构等对诊断、材料的来源、培养方式、手术及术后护理进行系统规范管理的。

6 问题与展望

组织工程技术是应用细胞生物学和工程学原理，研究开发制作用于修复、改善损伤组织结构和功能替代物的一门技术。其方法是取少量自体组织的某种细胞，在体外培养、扩增后，将其接种到支架材料上生长，再将此细胞支架复合物植入体内或缺损部位，种植的细胞继续增殖，形成新的组织和器官，达到修复缺损和重建功能的目的。组织工程技术自20世纪80年代兴起以来，迅速成为材料科学及生物医学领域的热点。角膜因其无血管透明，被称为“免疫赦免区”，在组织工程中具有重要的意义与地位。角膜组织工程与再生医学的目的不仅是要替换受损和功能障碍的组织，还要恢复有用视力，而只替换一层角膜病变组织以达到治疗的效果是最理想的治疗方法，因此角膜上皮重建对角膜组织的重建与再生具有重要意义。我国角膜组织工程学起步于1994年，建立稳定的角膜种子细胞体外培养体系，成功分离、培养，获取培养期更长、传代数更多、遗传特性更稳定的种子细胞，开发研制新的支架材料，替代功能不良与衰竭的角膜上皮组织，治疗不可逆的疾病与损伤，恢复健康的眼表及视功能，使患者不必经历反复手术，终生应用免疫抑制剂的痛苦，并创建具有自主产权的生物产品应用于临床一直是我国组织工程研究者奋斗的目标。因此我们必需真正懂得角膜组织工程相关因素发生发展的机制，进一步认识其真正的潜能，才能增加植片存活率。尽管在目前的研究与应用中还存在这样那样的问题，但不可否认的是角膜组织工程重建是能真正有希望治疗角膜盲疾病最有效的措施。

1 Pellegrini G，Traverso CE，Franzi AT，Zingirian M，Cancedda R， De Luca M.Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated human epithelium［J］.Lancet，1997，349(9057):990-993.

2 Chee KY，Kicic A，Wiffen SJ.Limbal stem cells:the search for a marker［J］.Clin Experiment Ophthalmol，2006，34(1):64-73.

3 Kerkis I，Kerkis A，Dozortsev D，Stukart-parsons GC，Gomes Massirosi SM，Pereira LV，et al.Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers［J］.Cells Tissues Organs，2006，184(3-4):105-116.

4 Ahmad S，Stewart R，Yung S，Kolli S，Armstrong L，Stojkovic M et al.Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche［J］.Stem Cells，2007，25(5):1145-1155.

5 Liu Qi，Chen WP.Research progress in the application of embryonic stem cells in vitro culture system in ophthalmology［J］. Yanke Yanjiu，2009，27(5):420-433.

6 Zhou SY，Zhang C，Baradaran E，Chuck RS.Human corneal basal epithelial cells express an embryonic stem cell marker OCT4［J］.Curr Eye Res，2010，35(11):978-985.

7 Nakamura T，Endo K，Kinoshita S.Identification of human oral keratinocyte stem/progenitor cells by neurotrophin receptor p75 and the role of neurotrophin/p75 signaling［J］.Stem Cells，2007，25(3):628-638.

8 Tao Q，Qiao B，Lv B，Zheng C，Chen Z，Huang H.p63 and its isoforms as markers of rat oral mucosa epidermal stem cells in vitro［J］.Cell Biochem Funct，2009，27(8):535-541.

9 Nishida K，Yamato M，Hayashida Y，Watanabe K，Yamamoto K，Adachi E，et al.Cornea reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium［J］.N Engl J Med，2004，351(12):1187-1196.

10 Dogru M，Tsubota K.Survival analysis of conjunctival limbal grafts and amniotic membrane transplantation in eyes with total limbal stem cell deficiency［J］.Am J Ophthalmol，2005，140(2): 305-306.

11 Du Y，Funderburgh ML，Mann MM，SundarRaj N，Funderburgh JL.Multipotent stem cells in human corneal stroma［J］.Stem Cells，2005，23(9):1266-1275.

12 Arnalich-Montiel F，Pastor S，Blazquez-Martinez A，Fernandez-Delgado J，Nistal M，Alio JL，et al.Adipose-derived stem cells are a source for cell therapy of the corneal stroma［J］.Stem Cells，2008，26(2):570-579.

13 Gomes JA，Geraldes Monteiro B，Melo GB，Smith RL，Cavenaghi Pereira da Silva M，Lizier NF，et al.Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of human immature dental pulp stem cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51 (3):1408-1414.

14 Meyer-Blazejewska EA，Call MK，Yamanaka O，Liu H，Schlötzer-Schrehardt U，Kruse FE，et al.From hair to cornea:toward the therapeutic use of hair follicle-derived stem cells in the treatment of limbal stem cell deficiency［J］.Stem Cells，2011，29(1): 57-66.

15 Madhira SL，Vemuganti G，Bhaduri A，Gaddipati S，Sangwan VS，Ghanekar Y.Culture and characterization of oral mucosal epithelial cells on human amniotic membrane for ocular surface reconstruction［J］.Mol Vis，2008，14(2):189-196.

16 Duan X，McLaughlin C，Griffith M，Sheardown H.Biofunctionalization of collagen for improved biological response:Scaffolds for corneal tissue engineering［J］.Biomaterials，2007，28(1): 78-88.

17 Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration［J］.N Engl J Med，2010，363(2):147-155.

18 Harkin DG，George KA，Madden PW，Schwab IR，Hutmacher DW，Chirila TV.Silk fibroin in ocular tissue reconstruction［J］. Biomaterials，2011，32(10):2445-2458.

19 Wu J，Du Y，Watkins SC，Funderburgh JL，Wagner WR.The engineering of organized human corneal tissue through the spatial guidance of corneal stromal stem cells［J］.Biomaterials，2012，33(5):1343-1352.

20 Yoeruek E，Bayyoud T，Maurus C，Hofmann J，Spitzer MS，Bartz-Schmidt KU，et al.Reconstruction of corneal stroma with decellularized porcine xenografts in a rabbit model［J］.Acta Ophthalmol，2012，90(3):e206-210.

21 Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbal stem cell therapy and long-term corneal regeneration［J］.N Engl J Med，2010，363(2):147-155.

22 Cheng CC，Wang DY，Kao MH，Chen JK.The growth-promoting effect of KGF on limbal epithelial cells is mediated by upregulation of Np63 through the p38 pathway［J］.J Cell Sci，2009，122 (Pt 24):4473-4480.

23 Tseng SC，Chen SY，Shen YC，Chen WL，Hu FR.Critical appraisal of ex vivo expansion of human limbal epithelial stem cells［J］.Curr Mol Med，2010，10(9):841-850.

24 Daya SM，Watson A，Sharpe JR，Giledi O，Rowe A，Martin R，et al.Outcomes and DNA analysis of ex vivo expanded stem cell allograft for ocular surface reconstruction［J］.Ophthalmology，2005，112(3):470-477.

25 Ahmad S，Osei-Bempong C，Dana R，Jurkunas U.The culture and transplantation of human limbal stem cells［J］.J Cell Physiol，2010，225(1):15-19.

26 Colabelli Gisoldi RAM，Pocobelli A，Villani CM，Amato D，Pellegrini G.Evaluation of molecular markers in corneal regeneration by means of autologous cultures of limbal cells and keratoplasty［J］.Cornea，2010，29(7):715-722.