甲床细胞体外培养的实验研究

高 峰，陈世玖，张丽杰，倪少俊，杨 军，李 智

(遵义医学院第五附属(珠海)医院手外、整形科，广东珠海519100)

指甲再生来源于甲根和甲弧影下方的甲床，此处的甲床称为甲母质。甲床提供指甲向远端生长的滑面，当甲床受损后，新生的指甲会出现不整齐现象而影响美观。因此，临床工作者们不懈地努力研究，不同类型的甲床损伤采用何种方式修复，术后能达到理想的效果。随着显微技术的发展，可根据情况选择不同的方法，完善了甲床损伤的治疗，如游离甲床移植术、皮瓣修复术、游离甲瓣修复术等。近些年，对甲床基础的研究相对较少，本实验旨在为深入研究甲床细胞奠定基础。

1 材料与方法

1.1 甲床上皮细胞组织块

培养 收集一名临床志愿者因经专科医师检查及超声波检查后发现胎儿死在宫内，进行立即引产，取得胎儿手指(经本人和家属知情同意)。将20周以上胎儿手指放入70%乙醇中浸泡5 min，取出后用磷酸盐缓冲液冲洗3遍。超净工作台内4倍手术放大镜下，切取甲床，放入含双抗的磷酸盐缓冲液中备用。将切取的甲床组织在培养皿内用眼科剪将其剪切成1 mm2的小块，均匀地平铺于25 cm2培养瓶底部，组织块与组织块之间保持0.5 cm左右的距离，加入无血清角化细胞培养基，于37℃ CO2培养箱中倒置培养3～4 h，待组织块黏着牢固时，加入0.001～0.002 L培养液，然后翻转培养瓶，使培养液慢慢浸润组织块，再轻轻且缓慢翻转正置培养瓶，使培养基刚好浸过组织块平面，以不令组织块漂起为标准。再于37℃ CO2培养箱中继续培养。24～48 h后补加培养液0.002～0.003 L，培养的前2 d应避免过多观察和晃动培养瓶，以防组织块脱壁。以后每天观察组织块的变化，21 d仍无细胞生长者予以淘汰。

1.2 甲床成纤维细胞组织块培养 收集、获得组织块及培养方法同1.1段所述。采用含10%血清的DMEM培养基。

1.3 细胞鉴定 甲床上皮细胞检测角蛋白17，免疫组织化学染色法，按试剂盒操作说明进行。成纤维细胞免疫荧光显微镜检测波形蛋白表达方法按公司产品说明书并按参考文献［1］进行。

2 结果

2.1 甲床细胞生长情况

2.1.1 甲床上皮细胞 倒置显微镜观察，2～3 d左右从组织块中游出，并在组织块周围形成生长晕，能游出细胞的组织块占贴附组织块的比例约1/3，13 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%，扁圆形或多角形细胞，呈铺路石样排列，其数目可达1×1010～1 ×1011个/L。

2.1.2 甲床成纤维细胞 2 d可见组织块周围有的细胞游离出来，呈放射状，3 d观察可见组织块周围有许多生长的细胞，呈圆梭形、长梭形、多角形等成纤维细胞的特征，胞体丰富，胞质均匀，细胞核清晰可见，11 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%。其数目可达1×1010～1×1011个/L。

2.2 甲床细胞的免疫细胞化学鉴定 培养的甲床上皮细胞70%以上特异性角蛋白17抗体染色阳性，证明培养的细胞为甲床上皮细胞;培养的甲床成纤维细胞抗波形蛋白抗体染色阳性，说明培养的细胞为成纤维细胞。

3 讨论

指(趾)甲和甲床作为皮肤的附属组织，具有与皮肤不同的组织结构，并由此具有特殊的功能，如对指功能和美容作用等。指(趾)甲由外胚层分化而来。第13周时，发育中的甲单位的上皮能够分成四层:基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，被称为甲床上皮。在20周时甲板完全覆盖甲床，并且甲床上皮完全失去颗粒层，此时，胎儿的甲与成人的甲基本相似。所以，本研究选择此时期胎儿甲床作为标本。甲床两种主要功能细胞，分别为上皮细胞和成纤维细胞，它对甲床的再生及形态的维持，起重要作用。

原代细胞的获取，有组织块培养法及消化法两种。由于大多数情况下难以获得大量的甲床标本，可以根据标本的大小来决定培养方法［2］。如果获得的标本较大，应用胰酶消化法;在获得的标本较小的情况下，则应用组织块法培养。甲床上皮细胞属于角化细胞，贴壁生长相对困难，为了促进角化细胞贴壁，不同学者采用过不同的方法。Nagae等［2］应用无血清培养基培养甲床细胞成功，证明角化细胞培养液是甲床细胞的良好培养基。刘东昕等［3］采用胰酶消化法及应用无血清角化细胞培养基培养甲床上皮细胞，获得成功。De Berker等［4］证实了甲基质部位上皮细胞增殖旺盛，是甲板的主要来源。

细胞角蛋白只在上皮细胞或外胚层起源的细胞中表达，在不同细胞中有不同亚型表达［5］。角蛋白是上皮细胞主要的结构蛋白和分化的标志产物。角蛋白分为两大类，即皮肤型角蛋白和毛发角蛋白。皮肤型角蛋白主要表达于皮肤等部位，毛发型角蛋白主要表达于毛发、指甲等部位。Berker等［6］的实验表明，在甲床的上皮细胞中表达K17蛋白。抗K17免疫组织化学染色，证实甲床上皮细胞，同时也说明甲床上皮细胞在体外培养条件下，蛋白的表达没有明显改变。刘东昕等［3］也通过实验研究应用抗K17免疫组织化学染色，证实甲床上皮细胞。

本实验应用组织块培养法成功地培养出甲床上皮细胞及甲床成纤维细胞，也证实了甲床上皮细胞在无血清角化细胞培养液中生长良好。虽与酶消化法相比，获取细胞时间上相多较长，但组织块法为传统的细胞培养方法，容易操作，成功率高。而酶消化法的浓度及消化时间难以掌握，不易获取，实验成功率低。组织块培养时应注意以下几点:①实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验;②遵守细胞培养的无菌操作;③分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有利于细胞游离;④培养过程中避免组织块干燥脱水;⑤2 d内避免过多观察和晃动培养瓶，以防组织块脱壁。

甲床缺损是常见的手外伤类型，随着显微外科的发展，临床工作者在不断寻求甲床修复的最佳方法。虽然现在甲床修复方式较多，仍存较多缺点，如游离指(趾)甲床移植再造手指甲床，成活后指甲形态较美观，却会失去另一个相对次要的指(趾)甲;游离甲瓣修复术，可使伤指再生指甲、恢复手指感觉，却需要一个足趾付出较大的代价。所以不管采用何种修复方法，均存在一定弊端。如果体外构建组织工程甲床成功，将会避免以损害其他组织为代价。本研究体外培养甲床细胞成功，为进一步构建组织工程甲床奠定了基础。

［1］ Aicher A，Heeschen C，Mohanpt M，et al.Nicotine strongly activatesdendritic cell-mediated adaptive immunity-potential role for progressionof atherosclerotic lesions［J］.Circulation，2003，107 (4):604-611.

［2］ Nagae H，Nakanishi H，Urano Y，et al.Serial cultivation of human nail matrix cells under serum-free conditions［J］.J Dermatol，1995，22(8):500-566.

［3］ 刘东昕，路来金，王虎.胰酶分次消化及无血清角化细胞培养基培养甲床上皮细胞的体外实验［J］.中国临床康复，2006，10 (5):40-41.

［4］ De Berker D，Angus B.Proliferative compartments in the normal nail unit［J］.Br J Dermatol，1996，135(4):555-559.

［5］ Carmona FD，Ou J，Jiménez R，et al.Development of the cornea of truemoles morphogenesis and expressionof PAX6 and cytokeratins［J］.J Anatomy，2010，217(5):488-500.

［6］ De Berker D，Wojnarowska F，Sviland L，et al.Keratin expression in the normalnail unit:markers of regional differentiation［J］.Br J Dermatol，2000，142(1):89-96.