微流芯片在口腔细菌定量检测中的初步应用

余 洋 综述;刘 彦，牛忠英 审校

(解放军第306医院全军口腔疾病诊疗中心，北京100101)

1990年，瑞士科学家首次提出“微全分析系统”的概念［1］。近年来，随着超微加工技术的发展，这一分析技术在生物学和医学领域的应用研究已经成为一个热门方向［2-5］。持续的研究相应促进了该技术的不断进步，使其应用范围不断扩大，2007年，有学者开始将这一技术引入口腔疾病诊断领域［6］，2011年裴振华，朱涛等首次将微流芯片技术应用到口腔细菌学研究中［7］。本文就微流芯片技术在口腔细菌定量检测中的应用现状做一综述。

1 微流芯片

微流芯片又称微流控芯片、芯片实验室或微全分析系统［8］，是利用微加工技术在芯片上制做微阀、微通道、微反应仓、微传感器、微压力器、微检测器等多种微流结构而构成的微型分析系统，在该系统中可完成样品的预处理、生化反应、分离、积聚、检测等功能，体现了将分析实验室的功能转移到芯片上的设想。

2 微流芯片与细菌定量检测

微流芯片检测细菌，所需样本液量小，能够大大缩短检测时间，易于实现设备的集成化和自动化，因此该方法已经成为近年来许多学者关注和研究的方向［9-11］。根据检测原理的不同大致可分为电化学阻抗谱检测、光学检测、阻抗脉冲检测和其他一些检测方法等。

2.1 电化学阻抗谱检测

给所测样本液施加一个小振幅的频率不同的交流电势波，系统阻抗值会随着频率的变化而改变，每一个频率值对应着溶液一个确定的电阻抗值，这就形成了阻抗谱图［12］。电化学阻抗谱法因其对待测样本表征和整体性能变化的敏感性，成为分析复杂电阻抗系统的强有力的工具［13］。根据细胞的电生理和阻抗特性，目前用阻抗谱定量检测细菌细胞的研究方法分为三个方向:①细菌正常代谢产生的离子释放和胞膜上离子交换，会引起系统阻抗值的变化。Silley等［14］通过测量这种阻抗信号，实现细菌数量的测量;②由于细胞膜的绝缘特性，细胞贴附在微电极表面上时，电极的表面积会减小，从而引起界面阻抗的增加，当细菌的粘附范围达到一定程度时，能够产生可检测的阻抗信号。Varshney等［15］正 是 利 用 这 一 原 理，进 行 了O157∶H7型大肠杆菌的定量分析，同时，为了得到较强的阻抗信号，这些系统大多使用了氧化还原探针，比 如 ［Fe(CN)6］-3/-4，检 测 范 围 可 达104～107cfu/mL，整合纳米微珠磁性分选技术的微流芯片的应用，使细菌数量检测限度达到102～106cfu/mL［16-17］;③细胞内胞质富含离子，使用一定的方法裂解细胞或促使其释放内部所含的带电离子，就能够检测到阻抗的变化。电通透作用可大大提高细胞膜的离子通透性，从而增加离子释放，科研人员用此种方法，可检测低至102cfu/mL大肠杆菌［18］。Yang 等［19］用去离子水悬浮大肠杆菌，促使高离子浓度细胞质向外界环境释放离子，通过测量去离子水溶液阻抗值变化，可获得细菌浓度，该套系统的检测范围达至105～109cells/20 μL。

2.2 光学检测

根据光学原理的不同，这一领域里可细分为吸光光度检测、化学发光检测、荧光检测等检测技术。

2.2.1 吸光光度检测

吸收光度检测是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，包括比色法、可见紫外吸光光度法、红外光谱法等。它具有灵敏、准确、快速、可测定的物质种类多、仪器结构较简单等优点，适用于微量组分的测定。Lin等(2004)［21］报告了一种应用比色分析法检测大肠杆菌的微流芯片，菌体与金纳米微珠(直径80 nm)上包被的抗体发生免疫反应，比色定量测定溶液颜色强度的改变，系统的检测限为10 ng。Li等［21］设计的微流芯片，含有免疫固定的抗体，捕获大肠杆菌后，用紫外-可见分光光度计进一步检测，最低检测限为102cfu/mL。

2.2.2 化学发光检测

在一些特殊的化学反应中，基态分子吸收反应中释放的化学能跃迁至激发态，处在激发态的分子以光辐射的形式将能量释放而返回基态，产生化学发光。化学发光检测正是通过测量这些反应中的光强度来测定被测物质的含量。这种方法具有很高的灵敏度，且不需要光源，仪器设备简单，易于集成化，是微流控芯片分析系统理想的检测方法之一。Han等［22］制作了Y型腔道的PDMS材料的微流芯片，大肠杆菌K1Ⅱ型与共轭抗大肠杆菌多克隆抗体的羧基聚苯乙烯微球，分别通过Y型腔道的两侧进样口注入芯片，两者在中间的汇聚腔道发生乳胶免疫凝集反应，用“极近”芯片的光纤测定反应时光散射强度的增加量，将结果绘制成光密度与菌浓度的校准曲线进行定量分析，可检测的浓度范围为0～104cfu/mL。

2.2.3 荧光检测

激光诱导荧光检测法，是目前微流控芯片系统中最常用的检测方法，具有很高的灵敏度、良好的选择性和较宽的线性范围。基于激光诱导荧光原理的检测器也是目前芯片商品化趋势中唯一被采用的一种检测器。大多数生物细胞能够产生自体荧光，荧光来源于机体的代谢产物和自身组分。Bao等［23］发明了一种能够对细菌裂解产物产生的自发荧光进行激光诱导检测的微流芯片，试验中观察到三种标准菌-李斯特菌F4244、肠炎沙门菌PTI和大肠杆菌O157:H7EDL933的自发荧光密度随菌数量的增长而增加，两者几乎成线性关系。该芯片检测限为240～4 100 cells/mL。微流芯片技术的引入，成功实现了流式细胞仪的微型化，整合流式细胞术的微流芯片定量分析也因此成为近年来学者们研究的一个热门方向。Skamoto［24］的研究组应用设计的此类芯片检测河水中的大肠杆菌，能够检测到的浓度范围达106～107cells/mL，而他们通过对实验条件摸索优化之后重新设计的芯片，对荧光标记的大肠杆菌检测限达到104～106cells/mL。

2.3 阻抗脉冲检测

阻抗脉冲检测是检测单个粒子和细胞大小及数量的一种优质方法，它能够检测出非导电粒子通过感应腔道时电阻抗值的变化。目前广泛应用的库尔特计数器正是这一技术强大生命力的体现。微纳米技术的进步，使基于微流芯片技术的微型化阻抗脉冲检测器检测微纳米粒子成为现实。Song等［26］使用的微流芯片由一个单腔道和两个定位在传感部分末端的检测壁腔道和外部链接的两级差分放大器组成，细菌流过感应部分的流速与菌浓度成线性函数关系。利用高信噪比信号，系统完成了4种不同细菌—李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、绿脓杆菌的定量分析，检测限精确到5×106～5×107cfu/mL。Skamoto［27］的研究组应用课题组设计的此类芯片检测河水中的大肠杆菌，能够检测到的浓度范围达106～107cells/mL，而他们通过该实验摸索了优化条件之后重新设计的芯片，对经荧光标记的大肠杆菌检测限达到104～106cells/mL。

3 微流芯片在口腔细菌定量分析中的初步应用

总结近年来芯片实验室技术在一般细菌学定量检测中的现况，研究主要集中在食源性致病菌和外界环境中常见的微生物的计量分析上，而该技术在口腔致病菌检测上的应用研究刚刚起步。裴振华，朱涛等(2011)［27］率先应用自己设计的基于液体电极的微流芯片，结合电化学阻抗谱原理，定量检测了成人牙周炎主要致病菌-牙龈卟啉单胞菌，研究发现不同浓度的牙龈卟啉单胞菌的电化学阻抗谱有显著差异，通过阻抗值可以区分不同浓度的牙龈卟啉单胞菌。该研究成为微流芯片在口腔细菌学领域应用的开端。

3.1 基于液体电极微流芯片结构特点

这个芯片由前部三条进样腔道、中间一条检测腔道和尾部3条废液排出腔道组成。实验时由外侧的两个进样腔道匀速注入高导电的氯化钾液，中间的进样腔道匀速注入一定浓度的细菌悬浮液，根据流体的流动聚焦原理，两侧的氯化钾液会挤压中间的菌悬液形成稳定的层流，这里的氯化钾液不仅具有鞘流作用，而且作为整个芯片系统的液体电极使用。因此该液体电极与固体电极相比具有操作便利、所需试剂简单、费用低廉等优点，同时可在很大程度上减少固体电极中可能存在的样本液与金属反应的现象，具有较高的临床应用价值［28］。

3.2 微流芯片定量检测牙龈卟啉单胞菌的原理

牙龈卟啉单胞菌标准菌株经过复苏、培养、增菌、计数板计数、梯度稀释、离心、洗涤后，用去离子水重悬静置20 min，以促使细菌细胞质中的离子充分释放。研究中发现:如果流体流速过快，会造成芯片的渗漏，而流速过慢时，流层交界处图像模糊，实验结果不可靠。因此经过对实验条件的摸索，样本液及氯化钾液的流速定在1 mL/h。为了进一步证明该流速对检测敏感性的影响，研究人员保持氯化钾液流速不变，菌悬液分别以1.5 mL/h和2 mL/h的速率流动，将阻抗分析仪记录的数据制成电导-菌浓度对数线性关系图，通过分析发现:流速为1 mL/h时，线性斜率最大，这就意味着此时芯片敏感性最高。实验证明:当交流电压的频率为100 Hz～10 kHz时，不同浓度的细菌液阻抗值有显著差异，随着细菌浓度的增加，阻抗值梯度减小;同一浓度的菌液，阻抗-频率曲线基本是一条与横轴平行的线，进一步分析系统等效电路可知，低频时系统电路阻抗相当于电阻R的阻抗，针对本研究体系，其中电阻包括细菌液和高导电氯化钾液的共同电阻，而由于高导电氯化钾溶液的电阻相对很小，所以主要可用细菌液的电阻来解释;而当频率超过100 kHz时，这一现象消失。因为在高频率时，系统阻抗值的变化主要受双层液电容阻抗而不是细菌液阻抗的影响，因此系统阻抗与细菌浓度之间无明显对应关系。当频率恒定在1.2 kHz时，细菌浓度的对数与阻抗值呈线性关系，相关系数达0.99。芯片能够区分浓度为:103～109cells/mL［27］。该项技术申请了专利:一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片(申请号:201010100832.2)。

4 微流芯片技术在临床口腔细菌学检测中应用

4.1 特异性检测方法的建立

检测方法的高度特异性，是临床运用的首要条件，为此研究者采用牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K抗体包被的纳米磁珠对细菌进行特异性捕获，外加磁场下进行免疫磁分离，最后通入芯片检测。为了验证这种方法的特异性，实验中使用中间普氏菌作为杂菌与牙龈卟啉单胞菌混合，用纳米磁珠蛋白酶K抗体复合物与混合菌液反应，最后通过PCR方法鉴定磁珠捕获的细菌。同时为了验证该方法在复杂口腔环境中应用的可行性，磁珠抗体复合物分别与含有(2.13×103～2.13×109)cells/mL牙龈卟啉单胞菌的唾液、血清、脓液反应，免疫磁分离后通入芯片检测阻抗谱的变化。通过研究发现:结合免疫磁分离技术后，芯片对细菌的检测限升高;免疫磁分离法特异性好;唾液和血清对牙龈卟啉单胞菌的检测限无明显影响，但唾液使检测灵敏度有所降低。脓液使牙龈卟啉单胞菌的检测限及检测灵敏度明显降低［31］。

4.2 检测粘结性牙周夹板固定病人龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌和血链球菌

裴振华(2011)［29］利用微流芯片结合免疫磁分离方法，建立了牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的阻抗—细菌浓度对数线性关系图和函数式。通过关系式量化分析了粘结性夹板固定病人初诊、夹板固定即刻、固定后2周、4周时炎症和健康对照位点龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌和血链球菌，同时记录相应阶段牙周临床指标包括菌斑指数、龈出血指数、探针深度和临床附着水平的变化，通过与临床指标和细菌培养以及实时定量PCR结果作对照，分析粘结性牙周夹板固定前后牙周微生态的变化，对该方法的临床应用价值进行了初步评估。

5 结论

应用微流芯片定量检测口腔细菌尚处在初步研究阶段，它为口腔细菌学领域里细菌定量检测的方法开辟了新的途径。由于口腔环境的复杂性，临床所取样本含有众多的干扰因素，少量杂菌的混入以及样本预处理过程中可能引入的一些离子成分、抗体的结合率，反应的温度、时间、反应物浓度、pH等都会对检测系统的稳定性、敏感性产生影响。因此，进一步优化实验条件，完善试验方法，设计更加敏感、特异、抗干扰能力强的芯片，提高临床应用价值，将成为该领域未来的重点研究方向之一。

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