维甲酸在内耳发育中的作用及其机制

管 明 徐娅苹

感音神经性耳聋患者在临床上多见，约占总人口的10%。主要是因为衰老、噪声、耳毒性药物、外伤、感染、肿瘤、遗传、免疫等体内外因素所致，且哺乳动物耳蜗毛细胞破坏后再生能力有限，常引起不可逆性的听力下降，治疗困难。随着内耳发育机制研究的深入和干细胞组织工程技术的逐渐成熟，科学家们发现许多因子，如EGF、FGF、TGF－α、甲状腺素等在内耳毛细胞、支持细胞的分化、成熟、再生中起作用，试图通过加入这些活性因子促进毛细胞再生，或诱导干细胞分化为毛细胞来治疗感音神经性耳聋。维甲酸(RA)作为维生素A的活性衍生物，在许多器官的发育中必不可少。同样，RA在胚胎期内耳发育和出生后内耳功能维持中起关键作用。本文就维甲酸合成酶、维甲酸分解酶，维甲酸受体在内耳中的特异性表达及维甲酸在内耳发育中的作用及其机制做综述。

一、维甲酸的代谢及维甲酸合成酶和分解酶在内耳的分布

1．维甲酸的代谢:在细胞内，维生素A与维生素A结合蛋白(CRBP)紧密结合后，首先，在酒精脱氢酶家族(ADH家族)的作用下，维生素A氧化成视黄醛;接着，视黄醛在视黄醛脱氢酶(RALDHs，又称RA合成酶，包括 RALDH1、RALDH2、RALDH3、RALDH4)的作用下，视黄醛氧化成全反式维甲酸(ATRA)和9－cis维甲酸(9－cisRA)［1］。而在细胞色素 P450超家族成员CYP26(又称RA分解酶:包括CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1)的作用下，RA被代谢分解。RA在内耳的特定时间、特定部位的表达是通过RALDHs和CYP26来调控的，所以了解RALDHs和CYP26在内耳的表达有助于我们理解RA在内耳发育过程中的作用。

2．RA合成酶在内耳的表达:RALDH1、RALDH2、RALDH3存在于胚胎第9．5～10天(E9．5～10)的听泡中。在 E10．5，RALDH1、2、3表达局限于听泡上皮。其中RALDH1表达范围最广，表达在内淋巴管原基和听泡上皮腹外侧;RALDH2仅表达于听泡上皮侧面;RALDH3表达于听泡上皮腹侧和中间区。在所有 RALDH中，RALDH2在此期表达量最高。在E12.5，RALDH1、2、3 存在于将发育为前庭、耳蜗上皮的听泡上皮区，另外RALDH1、2还存在于内淋巴管上皮中。在E14．5，RALDH1存在于半规管上皮、内淋巴管、壶腹嵴;RALDH2存在于前庭邻近壶腹嵴的上皮区及耳蜗非感觉上皮区。在E18．5，RALDH1局限于前庭球囊、椭圆囊和嵴的一些区域及耳蜗柯替氏器。RALDH2局限于耳蜗血管纹、前庭膜及前庭邻近壶腹嵴的上皮区。而在 E14．5、E18．5，RALDH3 均表达于半规管、壶腹嵴、球囊、椭圆囊的感觉上皮区及耳蜗螺旋神经节［2］。

3．RA 分解酶在内耳的表达:在 E9．5，CYP26A1已存在于听泡上皮侧面和腹侧，及其周围间质。在E10．5，CYP26A1局限于听泡上皮的腹侧，但在周围间质腹侧、中间区、侧面表达丰富;CYP26B1表达局限于听泡上皮侧面和中间区;CYP26C1存在于听泡上皮腹侧和间质区。在E12．5，CYP26A1表达在听泡上皮腹侧、侧面，及围绕后半规管的间质区;CYP26B1表达在听泡间质的腹侧及围绕水平半规管的间质区，并存在于将发育为前庭、耳蜗感觉上皮的听泡上皮区。随着胚胎发育，CYP26A1表达下降，在E14．5局限于耳蜗和球囊，在E18．5未发现有表达。相反，CYP26B1在 E14．5、E18．5 的耳蜗、前庭感觉上皮有高水平表达，在出生后开始下降。CYP26C1在E10．5～E12．5的听泡上皮腹侧和邻近间质表达［3］。

如上所述，在胚胎发育的不同时期，RA合成酶(RALDHs)和RA分解酶(CYP26)在内耳的表达部位不同，从而协调RA在内耳的表达，这是内耳发育所必须的。Frenz等［4］研究发现RA过量和不足都将导致内耳发育的畸形。

二、维甲酸受体在内耳的分布

维甲酸是通过结合于细胞核内特异性受体，调节目标基因转录，发挥作用的，维甲酸受体(retinoic acid receptors)的变异和缺失将引起内耳发育畸形。维甲酸受体属于细胞核受体中类固醇/甲状腺素激素超家族成员，分为两类:RARs和RXRs。RARs能被全反式维甲酸和9－cis维甲酸激活，而RXRs仅能被9－cis维甲酸激活。RARs可分为:RARα、RARβ、RARγ;而 RXRs包含 RXRα、RXRβ、RXRγ。每一种RARs又能和任何一种RXRs在体内外形成异二聚体。结合了维甲酸的RARs、RXRs、RARs/RXRs异二聚体通过RA反应元件(RAREs)作用于许多目标基因，转录功能蛋白，发挥生物活性作用。RA受体在转导RA信号上是必须的，了解RA受体在内耳的表达有助于我们了解RA在内耳发育中的作用。

在 E10．5，RARβ、RARγ 主要位于将发育成内淋巴管的听泡上皮周围间质细胞上。在E12．5，RARα位于听泡上皮大部分区域和邻近间质区域;RARβ主要位于听泡上皮中间区和邻近的间质上;RARγ局限表达在听泡周围间质上;RXRα在除了将发育为内淋巴管的听泡上皮没有表达外，在听泡上皮和周围间质广泛表达;RXRβ在听泡上皮广泛表达，还表达在周围间质侧面和中间区，但在腹侧没有表达;RXRγ局限于听泡上皮的特殊区域。在 E18．5，RARα、RARγ、RXRα、RXRβ 分布在耳蜗几个区域，相反RARβ、RXRγ局限于蜗轴和基膜。

如上所述，维甲酸受体在胚胎内耳的表达部位是特殊的，同样在胚胎内耳的发育中起着不同的作用。Romand等［2］提出听泡中央部位的感觉上皮RA信号的传导主要依靠RARα和3种RXR，其最终发育形成耳蜗和球囊，而RARγ和RXRα主要在软骨性耳囊(otic capsule)成形过程中起转导信号的作用。

三、维甲酸在软骨性耳囊发育中的作用

1977年，Lim首次提出RA在软骨性耳囊中的作用，接着RA在软骨性耳囊发育中的作用和作用途径得到了进一步的阐述。1996年，Frenz报道在胚胎发育的特殊时期，暴露于过多的外界ATRA下会使软骨性耳囊畸形发育。1998年，Underhill和Weston阐述RARS基因不适当的表达将抑制软骨性耳囊发育。2002年，Romand等［2］更加详细的阐述了RA在软骨性耳囊发育中的作用，并发现RARα和RARγ是RA调节内耳软骨性耳囊发育的受体。因为 RARα、RARβ、RARγ 基因单独缺失突变和 RARα/RARβ、RARβ/RARγ基因无效突变，并不产生内耳畸变，但RARα/RARγ基因无效突变，将产生严重的内耳畸变。主要表现在:①到胚胎第10．5天，听泡的大小只有正常的一半;②内淋巴管缺失;③到E14，半规管发育停止。

RA在软骨性耳囊发育中的作用途径:软骨性耳囊发育的早期，两条信号起了重要作用。①听泡上皮与周围间质之间的相互作用。La Mantia等［5］阐述在听泡发育的早期，间质和上皮之间的相互作用包含多条途径，而RA是上皮和间质之间相互作用的途径之一;②菱脑神经组织与听泡外胚层之间的作用。Mc－caffery等［6］报道菱脑神经组织和听泡外胚层之间的相互作用包含多种因子，而RA是其中的一种。如上所述，RA在软骨性耳囊发育的两条途径中都发挥了重要作用。

四、维甲酸在耳蜗毛细胞分化成熟中的作用

1．维甲酸在毛细胞分化和再生中的作用:①在生理条件下，RA存在于成年哺乳动物前庭上皮、鸟类前庭上皮和耳蜗血管纹上，而在成年哺乳动物耳蜗上没有发现RA的存在;相应的，成年哺乳动物前庭上皮和成年鸟类所有上皮均能再生，而成年哺乳动物耳蜗感觉上皮在无外加诱导条件的作用下不能再生，说明RA可能在内耳感觉上皮的发育中起作用;②在体外培养条件下，外源性RA的加入能促进毛细胞分化和再生。例如将小鸟听泡体外培养，加入RA后，引起毛细胞分化的提早和毛细胞数量的增加;新生大鼠耳蜗柯替氏器体外培养中，加入新霉素破坏耳蜗毛细胞，再加入RA后，可诱导毛细胞再生。

2．维甲酸促进毛细胞分化和再生的作用途径:在Raz的实验中，RA加入到胚胎柯替氏器培养体系中，诱导产生额外数量的毛细胞和支持细胞，这些额外数量的毛细胞和支持细胞并不是通过促使原有毛细胞和支持细胞有丝分裂产生的，所以RA的作用不是促进细胞的有丝分裂［7］。Raz认为RA的作用在于诱导内耳干细胞分化为内耳感觉前体细胞，然后内耳感觉前体细胞在细胞与细胞相互作用机制下发育成毛细胞或支持细胞。

五、维甲酸在内耳发育中所涉及的相关因子

1．HOXa－1基因:RARβ/RARγ基因无效突变引起的发育不全类似于HOXa－1基因缺失，将致大部分耳蜗结构如听觉毛细胞、螺旋神经元均缺失。而且HOXa－1启动子上拥有维甲酸反应元件(RAREs)，RA调节HOXa－1RNA的转录。所以HOXa－1基因接受RA的调节，对内耳的发育起作用。

2．FGF3基因:由中胚层和听泡邻近的神经组织分泌的FGF3是听泡发育的主要诱导因子，而RA和FGF3之间关系密切:①在Phillips体外培养实验中，RA诱导形成异位或额外数量听泡的作用，是通过诱导FGF3表达增加实现的，且拮抗FGF3即阻断外源性RA的作用，不形成异位或额外数量听泡;②在小鼠，RALDH2无效突变将引起FGF3表达下降和表达失控;③Wendling的实验发现 RARα/RARβ、RARα/RARγ无效突变的小鼠胚胎和维生素A缺乏的大鼠胚胎中，FGF3异位表达，并出现额外的小听泡;④Liu的研究结果显示，过量的RA将破坏FGF3信号通路，致内耳发育畸形［8～11］。所有这些实验都证实了FGF3在RA诱导听泡发育过程中起作用。

3．BMP基因:BMP基因是TGF超家族成员，至今已经发现14类BMP基因。BMP4在听泡上皮和临近周围间质中表达，是听泡软骨发育和毛细胞分化的调节因子。BMP4基因拥有RA反应元件，接受RA的直接调节，而且RA的作用是抑制听泡BMP4表达的。

4．Shh基因:Shh无效突变，产生内耳，尤其是耳蜗畸变，类似于RARα/RARγ无效突变引起的内耳畸形。而且Shh基因启动子上有RA反应元件，所以Shh基因接受RA的调节，对内耳的发育起作用。

5．TGF－β基因:TGF超家族成员之一，包括TGF－β1和TGF－β2。TGF－β在听泡上皮上表达;Butts的研究发现:在体外培养中，加入致畸水平的RA，将使TGF－β表达下降，从而抑制软骨发育，影响感觉上皮分化。

6．OTX1和OTX2基因:OTX1和OTX2是RA可能的下游作用因子。在听泡中表达，对半规管和耳蜗的形成起作用。在鼠胚胎期内耳中，OTX2的表达对RA的浓度高度敏感。

7．其他:McCaffery等［6］报道一些生长因子同样受RA调节，包括NT－3、BDNF。它们在听泡中表达，是位听神经节神经元存活所必需的。

综上所述，维甲酸合成酶、维甲酸分解酶、维甲酸受体、维甲酸在内耳有着特异性协调表达，维甲酸在内耳听泡软骨和内耳感觉上皮细胞分化中起作用，是听泡形成和内耳感觉上皮细胞分化的重要条件之一。尽管我们例举了在内耳发育中与维甲酸有关的许多因子，但是究竟是哪些因子在其中起着最为重要的作用，以及他们相互之间关系还有待进一步阐明。

1 Lin M，Zhang M，Abraham M，et al．Mouse RALDH4:molecular cloning，cellular expression，and activity in 9 －cis－retinoic acid biosynthesis in intact cells［J］．JBiol Chem，2003，27(11):9856 －9861

2 Romand R，Hashino E，Dolle'P，et al．The retinoid acid receptors RARα and RARγ are required for inner ear development［J］．Mech Dev，2002，119(2):213－223

3 Tahayato A，Dolle'P，Petkovich M．Cyp26C1 encodes a novel retinoic acid－metabolizing enzyme expressed in the hindbrain，inner ear，first branchial arch and tooth buds during murine development［J］．Gene Expr Patterns，2003，3(4):449－454

4 Frenz DA，Liu W，Cvekl A，etal．Retinoid signaling in inner ear development:a“Goldilocks”phenomenon［J］．Am J Med Genet A，2010，152A(12):2947 －2961

5 La Mantia AS，Bhasin N，Rhodes K，et al．Mesenchymal/epithelial induction mediates olfactory pathway formation［J］．Neuron，2000，28(2):411－425

6 McCaffery P，Drager UC．Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous system:a master differentiation factor［J］．Cytokine Growth Factor Rev，2000，11(3):233－249

7 Raz Y，Kelley MW．Retinoic acid signaling is necessary for the development of the organ of Corti［J］．Dev Biol，1999，213(1):180 － 193

8 Hatch EP，Noyes CA，Wang X，et al．Fgf3 is required for dorsal patterning and morphogenesis of the inner ear epithelium［J］．Development，2007，134(20):3615 －3625

9 Phillips BT，Bolding K，Riley BB．Zebrafish fgf3 and fgf8 encode redundant functions required for otic placode induction［J］．Dev Biol，2001，235(2):351－365

10 Wendling O，Ghyselink NB，Chambon P，etal．Rolesof retinoic acid receptors in early embryonic morphogenesis and hindbrain patterning［J］．Development，2001，128(11):2031 － 2038

11 Liu W，LeviG，Shanske A，et al．Retinoic acid－induced inner ear teratogenesis caused by defective Fgf3/Fgf10－dependent Dlx5 signaling［J］．Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol，2008，83(2):134－144