结缔组织生长因子与恶性肿瘤的研究进展

天津医科大学总医院天津市肺癌研究所ICU 徐萧洪

临床上，80%以上的恶性肿瘤病人死于肿瘤的侵袭和转移，可见恶性肿瘤的侵袭和转移是导致治疗失败和死亡的主要原因。随着分子生物学的进展和对肿瘤发生遗传机制的进一步了解，以及对恶性肿瘤发生、发展过程和预后的细致深入研究，人们发现恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段多因素共同参与的生物学过程。肿瘤的转移过程包括肿瘤细胞从原发肿瘤中脱落、肿瘤细胞侵袭间质组织、肿瘤细胞进入血管以及肿瘤细胞在第二位置的溢出和生长[1,2]。为了进行转移，肿瘤细胞必须通过激活和(或)抑制作用来调节细胞的增殖、分化及迁移运动。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF) 是1991年Bradham 等[3]在应用血小板源性生长因子(platete rivied growth factor,PDGF) 抗体筛选人类脐静脉内皮细胞cDNA(互补脱氧核糖核酸) 文库时首次发现。

1 CTGF的蛋白质结构

C T G F属于C C N家族，此家族包括结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、Cyr61(cysteine-fich 61)、肾母细胞瘤过度表达基因(nephroblastoma overexpressed gene，Nov)、elml (expressed low in metastasis 1) 或称WISP-1(Wnt-1 induced secreted protein 1)、HICP(heparin-inducible CTGF／cyr6 1／nov-like protein或rcop-1或WISP-2)和WISP-3，已在人、小鼠、大鼠、猪、牛、鹌鹑和蛙等组织中检测到该家族成员的表达。大部分CCN家族成员的翻译产物是含有343～381个氨基酸残基的相对分子质量为35 000～40 000的分泌蛋白，这些蛋白都含有38个保守的半胱氨酸，由4个结构模块构成。它们均属于即刻早期基因(immediate early gene)，直接参与生长因子对细胞生长分化的调控。它们的共同结构特点是具有很高的序列同源性和序列结构类似性。CTGF蛋白的相对分子质量约为38 000，富含半胱氨酸，是肝素结合型，由成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌。CTGF mRNA可以在成年哺乳动物的心、脑、肾、肺、肝、肌肉和胎盘中表达。人类CTGF基因定位于染色体6q23. 1，包括5个外显子和4个内含子，起始位点为ATG 其3′端包含3个ATTTA位点。CTGF蛋白的38个保守的半胱氨酸残基分成2个节段，其中22个在N末端区，16个在C末端区，4个主要的蛋白结构区为胰岛素样生长因子的结合蛋白区、von Wille-brand因子C型重复、血小板反应蛋白( throm bospondin) I 型重复以及生长因子半胱氨酸群，这些区域都由独立的外显子编码。

2 CTGF的生物学功能

CCN家族蛋白分泌细胞外基质联合蛋白，调节细胞生长过程(例如黏着、转移、有丝分裂、分化和残存)，他们也调节更多复杂的生物过程(如血管发生、软骨形成、肿瘤形成、纤维变性和血管疾病)。CTGF蛋白除具有上述功能外，还有自己特有的生物学功能。

2.1 促进血管形成 动物正常组织内各种管腔内皮细胞均可产生CTGF，CTGF在血管内皮细胞中呈原位表达，目前认为是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或血管内皮生长因子(VEGF)激活转录所致。CTGF可作用于内皮细胞，调节其生长，维持正常内皮细胞内环境的稳定，纯净的重组体CTGF(rCTGF)促进血管内皮细胞黏附、增殖和迁移，并呈剂量依赖性。损伤修复和纤维化疾病常同时出现细胞外基质沉积和血管形成。CTGF可促进ECM成分的产生，被认为在结缔组织细胞增殖和ECM沉积中占有重要地位。CTGF在成纤维细胞中过度表达可引起MMP1、MMP2和MMP3的表达增强，从而证实CTGF与ECM的产生和降解关系密切[4]。CTGF是一种有效的血管生成因子，rCTGF可显著地促进血管内皮细胞形成管腔，同时诱导血管内皮细胞形成管状，比碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子作用强。

2.2 介导细胞粘附 CTGF促进细胞黏附、增殖和存活的功能是通过内皮细胞的α5β3整合素、血小板的α2bβ3整合素和αbβ1整合素及成纤维细胞表面的乙酰肝素硫酸酯蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycans，HSPGs)介导完成的。Chen等[5]研究发现，CTGF能够介导成纤维细胞的黏附作用，其过程必须要有整合素和硫酸乙酰肝素糖蛋白的参与。此外，与成纤维细胞黏附至纤维结合素、层黏连蛋白和Ⅰ型胶原相比，CTGF介导黏附作用的范围更加广泛，表现为形成线状和扁平伪足的时间更长，可以激活细胞内信号转导分子如黏连激酶，至少可以维持p42／p44 MAPKs(mitogen activated protein kinase，丝裂原激活的蛋白激酶)的激活状态达9 h，以及延长基因表达的时间。

2.3 促进软骨发生和骨骼发育 CTGF基因在兔的软骨细胞和人的软骨肉瘤细胞中均有强阳性表达，而成骨细胞中则无表达。原位杂交结果显示，CTGF主要表达于胎鼠的肋软骨细胞和脊柱的肥大软骨细胞中。以上结果表明，CTGF参与软骨内成骨。XU等[6]发现大鼠骨硬化病模型和正常大鼠的骨骼之间存在CTGF基因表达的显著差异。此外，前列腺素E(2)可以上调CTGF基因的表达，而前者已知可以调节成骨细胞的分化，在骨骼发育过程中起重要作用。因此，CTGF在软骨的发生和骨骼的发育、塑形以及重塑过程中发挥着重要作用。

2.4 刺激细胞迁移 Fan等[7]发现，在体外实验中，如果CTGF表达过度，血管平滑肌细胞的生长率和迁移率都将有显著增加，而且该作用可被CTGF中和性抗体逆转。在培养皿中只有那些处于增殖期和正在迁移至空白区域的细胞CTGF表达呈阳性，CTGF这种趋化细胞的作用可以促进它的促新生血管形成活性，并且可能在创伤愈合过程中趋化成纤维细胞至伤处起重要用。

2.5 在器官纤维化中的表达 在生理状态时，机体组织细胞可有基础量的CTGF分泌；病理状态下，CTGF过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生密切相关。CTGF与多种组织器官纤维化有密切的关系，包括肺纤维化、肾脏纤维化、系统性硬化、动脉粥样硬化和肝脏纤维化。

2.5.1 在肺纤维化中的表达 SATO等[8]应用Northern杂交方法观察了CTGF mRNA在bleomycin诱导的人、大鼠和小鼠肺纤维化模型中各个阶段的表达特点，首次证明人、鼠肺成纤维细胞也表达CTGF，其表达规律与TGF-β1有着密切的联系，与肺纤维化的程度密切相关。

2.5.2 在肾纤维化中的表达 国外有关肾脏疾病的研究发现，CTGF参与了肾纤维化的发生、发展，可能是各种肾脏疾病所致肾纤维化中的一个共同的关键生长因子。初步研究表明，在肾脏疾病状态下，CTGF主要表达于肾脏中起源于中胚层的固有细胞，如脏层上皮细胞、壁层上皮细胞、系膜细胞以及肾小球和肾小管周围的间质细胞。

3 影响CTGF表达的因素

3.1 TGF-β1 在体外TGF-β1可以诱导人包皮的成纤维细胞产生高水平的CTGF以及细胞外基质成分，而其他生长因子如血小板源生长因子、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等则没有这种作用。环己亚胺不能阻断这种刺激作用，这表明CTGF基因的表达是由TGF-β1直接调控。在组织创伤修复时，再生组织中TGF-β1表达的增高发生在TGF表达增高之前，这表明体内存在着控制组织再生和修复的级联反应。

有研究者将TGF-β1和CTGF注射至新生小鼠的皮下，以观察这两种生长因子在体内的促纤维化作用。结果表明，持续纤维化组织的形成需要几种生长因子的共同作用，其中TGF-β1诱导纤维化，而CTGF则维持纤维化的发展。此外，应用CTGF反义寡核苷酸或中和性抗体则能抑制TGF-β1诱导皮肤纤维化的作用，表明TGF-β1是通过CTGF的介导才能发挥其促纤维化作用。

3.2 肿瘤坏死因子 最近的研究发现，肿瘤坏死因子(TNF)对促进炎性反应的发生和诱导基质金属蛋白酶基因的表达是十分必要的，并在创伤愈合的早期阶段发挥着重要作用。研究发现在体外培养的成纤维细胞中TNF能够抑制TGF-β1诱导CTGF蛋白的表达。这种作用能够被核转录因子kappaB(NF-kappaB)的抑制剂阻断，表明TNF可能通过NF-kappaB的信号通路发挥作用。

4 CTGF在恶性肿瘤中的作用机制

CCN家族具有广泛的生物学特性，在肿瘤病理方面有着复杂多样的表现。有证据表明，CCN的表达异常与恶性肿瘤之间有着明显的相关性。CTGF属于CCN家族，也是CCN家族中研究较多的一个。

CTGF在肿瘤中的作用目前还不是很清楚，有研究显示CTGF可能在肿瘤生长和血管生成中起作用。近来研究发现，胰腺癌和软骨肉瘤中CTGF的表达水平升高，在约6l%的急性淋巴细胞白血病患者的骨髓中也出现CTGF的过度表达[9]。Xie等[10]采用实时定量PCR法对44例原发性乳腺肿瘤和7例正常乳腺组织中CTGF、WISP-1、Cyr61和Nov mRNA的表达水平进行定量分析时发现，在原发性乳腺肿瘤中存在CTGF mRNA(55%)、WISP-1 mRNA(46%)、Cyr61 mRNA(39%)和Nov mRNA(11%)的过度表达。统计学单变量分析CCN基因表达和临床病理参数的关系时发现，CTGF与病程、肿瘤大小、淋巴结转移状况和确诊时年龄显著相关。在一类儿童成肌纤维细胞性肿瘤中，如婴儿肌纤维瘤病、恶性血管外皮瘤和纤维组织细胞瘤的内皮细胞和弹性蛋白阳性的瘤细胞中CTGF均有高度表达，而在血管纤维瘤中CTGF只表达在Ⅷ因子阳性的内皮细胞和血管平滑肌细胞中。用原位杂交法在肿瘤组织炎性细胞内没有检测到CTGF mRNA[11]。Croci等[12]将CTGF反义寡核苷酸和反义RNA导入横纹肌肉瘤细胞，2种处理方法都使瘤细胞的生长得到抑制，提示可能存在一个以CTGF为基础的自分泌环状通路。CTGF反义核苷酸介导的生长抑制是由于其显著促进了细胞凋亡，而对细胞增殖没有影响。重组的CTGF大大增加了肌球蛋白阳性细胞的比例。Shimo等[13]发现，CTGF的反义寡核苷酸和反义RNA均可抑制内源性CTGF引起的血管内皮细胞增殖和游走，从而抑制血管形成。在大血管的内皮细胞中，cAMP可抑制CTGF降解，增加CTGF蛋白的产生，而TGF-β1对CTGF mRNA和蛋白没有影响；但在微血管内皮细胞中，TGF-β1则可增加CTGF mRNA的产生，且TGF-β1与cAMP均促进CTGF的降解。CTGF在抑制恶性肿瘤的转移方面可能也有作用，有报道CTGF可通过一种CRMP-1(collapsing response mediator protein-1)依赖的通路抑制肺腺癌的侵袭和转移[14]。

5 小结

总之，CTGF具有多种生物学特性，在不同的肿瘤、不同的病理类型中其功能可能不一样。CTGF作为肿瘤转移的调节因子之一，提示其可成为防治肿瘤转移的一个很有前途的新靶点。但目前CTGF的基因调控机制及活化机制尚不清楚，因此进一步探讨CTGF在肺癌的转移和侵袭中的表达将有一定的理论和临床意义。

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