渐逝场荧光显微术的原理及应用

刘 洋，陈美霓

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

渐逝场荧光显微术(evanescent field fluorescence microscopy)是近十年多来新发展起来的一种显微镜技术。这种技术利用入射光发生全内反射(total internal reflection)时所产生的渐逝场(evanescent field)的能量来激发荧光物质，因渐逝场的穿透深度极有限，一般仅能激发界面附近100 nm左右的薄层区域，荧光信号不受深层荧光分子的干扰，图像信噪比和灵敏度均得到极大程度的提高，因而使得观察对象非常清晰，明显地优于传统的荧光显微镜技术［1-4］。渐逝场荧光显微术可对活细胞进行实时的动态观测，比如观察出胞作用和入胞作用现象，亦可对单个分子进行成像［5-9］。本文对渐逝场荧光显微术的原理、优缺点及应用做一介绍。

1 渐逝场荧光显微术的物理学基础

全内反射是一种普遍存在的光学现象，当一束光线从一种高密度介质(如玻璃)进入一种低密度介质(如水溶液或组织、细胞等)中时，在两种介质的界面处，入射光有一部分发生反射，另一部分则透射进入第二种介质内，入射角和透射角之间满足关系式 n1sinθ1=n2sinθ2，其中 n1和 n2分别代表两种介质的折射率。当入射角增大到等于或大于临界角(θc=arcsin(n2/n1))时，不再有光线透射进入第二种介质，即所有的光线都发生了反射，这一现象被称为全内反射。尽管从几何光学的理论来讲，当发生全反射时，所有光线都在两种介质的界面上发生反射而不进入第二种介质中，但实际上由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面穿透到第二种介质中去，向界面下传播，这种光场被称为渐逝场，亦称为渐逝波(evanescent wave)［10］。渐逝场或渐逝波的强度呈指数衰减，其扩散的深度通常只有几十至几百nm，因此，当观察细胞时，几乎完全排除了细胞自体产生的自发荧光的干扰。当荧光物质趋近玻片时，荧光亮度逐渐增加;当荧光物质移行离开玻片时，荧光亮度逐渐减弱［11］。

2 渐逝场荧光显微镜的类型

渐逝场荧光显微术可用两种方法实现，一种是基于棱镜，另一种基于物镜［1-4，10］。棱镜模式的渐逝场荧光显微术是在含有细胞样品的低折射率介质(如PBS溶液)上放置一个高折射率的棱镜。通过调节光学转移平台和反射镜的角度可以调节激光通过棱镜照射到含细胞的溶液上的角度，发生全内反射现象。物镜模式的渐逝场荧光显微术需使用高数值孔径的油镜，可通过调节入射光纤和激光的入射角度，从而将荧光的激发方式从宽场激发转换为物镜模式的全内反射激发。其过程如下:①入射激光在物镜的后聚焦平面中心汇聚，然后通过前透镜垂直入射进入盖玻片和细胞上，均一的照亮整个细胞，完成宽场荧光激发。②通过千分尺精密调节光纤的入射位置，使入射激光汇聚点偏离物镜后焦平面中心，从而通过物镜的前透镜以一个倾斜的角度照射到细胞上。③进一步调节入射激光焦点偏离物镜后焦平面中心的程度，使激光进入盖玻片细胞的角度增大。④当调节激光进入盖玻片细胞的角度增大到一定程度后，所有入射光都被反射回来，在细胞表面形成消散场。

3 棱镜和物镜模式渐逝场荧光显微术的比较

渐逝场荧光显微术的棱镜模式和物镜模式各有其优缺点。在棱镜模式下，入射激光的θ角很容易调节，故可得到相对纯粹的消散场。棱镜模式下的激光系统是一个开放的系统，不需要高数值孔径的物镜，相对物镜模式的渐逝场荧光显微术比较便宜。它的主要缺点是由于棱镜位于样品上，故而限制了样品的操作，并不利于渐逝场荧光显微术技术与其他技术如电生理技术的结合。此外，商业上也没有成熟的棱镜模式的渐逝场荧光显微术系统，亦给应用带来不便。渐逝场荧光显微术物镜模式的主要缺点是相对较昂贵，入射激光的θ角较难调节，而得到的全反射的消散场相对不纯粹。但是，它最大的优点是样品容易制备并易于在显微镜下操作，因此，在物镜模式下可以将渐逝场荧光显微术与许多其它的手段如膜片钳等电生理技术结合在一起。另一方面，物镜模式的渐逝场荧光显微术系统，在商业上已经很成熟，可以被很方便地添加到现有的各种荧光成像系统上［1-4，11］。

4 渐逝场荧光显微术与激光共聚焦荧光显微术的比较

渐逝场荧光显微术的优点主要是，由于渐逝场的穿透极浅，细胞深处的荧光分子基本不被激光激发，因此光漂白和光毒作用都很低。由于渐逝场荧光显微术的光学激发切面的深度为100 nm左右，远低于共聚焦显微镜的500 nm左右光学切面厚度，因此检测到的杂散荧光信号的背景也低于共聚焦。由于渐逝场荧光显微术只需要高数值孔径的物镜和激光光源，相对于其他的光学方法来说比较便宜。同时，渐逝场荧光显微术还可以与其他的非线性光学成像方法如荧光共振能量转移，荧光半衰期影像显微镜等方法结合使用。渐逝场荧光显微术的缺点主要是只能对细胞表面成像，而不能用于研究细胞深处的信号。另外，全内反射的信号对Z轴的漂移非常敏感［1-4］。

5 渐逝场荧光显微术在生命科学领域的应用

生命科学的现代发展，要求人们能够从单细胞和单分子的水平来观察生命的过程以及研究物质之间的相互作用，渐逝场荧光显微术在这两方面都得到了应用。

5.1 细胞表面事件检测

渐逝场荧光显微术非常适用于活细胞表面事件的研究，如出胞作用和入胞作用的观察研究［5，6，12］。出胞作用即细胞分泌，是指真核细胞中含有分泌物的囊泡与细胞膜融合，从而将内含物排出细胞外的过程。细胞分泌有组成性分泌和调节性分泌两种。组成性分泌所有真核细胞都有，是从高尔基体TGN区囊泡向质膜运输的过程，其作用在于更新膜蛋白和膜脂、形成细胞膜外周蛋白、细胞外基质、或提供营养成分和信号分子。调节性分泌:分泌细胞产生的分泌物(如激素、神经递质、粘液或消化酶)储存在分泌囊泡内，当细胞受到胞外信号刺激时，分泌囊泡与细胞膜融合将内含物释放出去。在细胞发生出胞作用后，通常在短时间内(数十毫秒)即出现入胞作用，将增加的质膜回收以维持细胞体积的稳定，并使囊泡回收从而循环利用。这些出胞作用和入胞作用的信号都发生在膜表面，因此可以用渐逝场荧光显微术的方法实时观察到。与出胞作用相反，入胞作用信号主要是通过检测全内反射层面下内吞相关蛋白的动力学特性来实现［5-7］。

5.2 单分子检测

渐逝场荧光显微术在单分子检测方面可应用于分子马达(molecular motor)的研究［9，13，14］。分子马达包括肌球蛋白、驱动蛋白、动力蛋白、核苷酸聚合酶等，它们能够沿着纤维型肌动蛋白、微管、DNA和RNA等线形分子的轨道运动。渐逝场荧光显微术能够精确地检测单个分子的位置和变化，故可用于观察研究分子马达的运动。Vale［13］等首先用渐逝场荧光显微术直接观察到荧光标记的单个驱动蛋白分子沿微管的运动。驱动蛋白是由两条轻链和两条重链构成的四聚体，其顶端或头部两个球形的结构具有ATP酶活性，可与微管交替结合与解离，从而可沿着微管一步一步地向前走。Vale［13］等在实验中发现，用Cy3荧光染料标记的驱动蛋白每次与微管相互作用后行走的平均距离为600 nm，而将驱动蛋白分子的一个头部切除后，则不能观察到行走现象，因而进一步证明了驱动蛋白在微管上的行走机理。迄今，通过渐逝场荧光显微术的单分子成像技术已经观察到了驱动蛋白超家族、RNA聚合酶和肌球蛋白V等分子马达的前进性运动。

6 小结

渐逝场荧光显微术是近年来最热门的显微成像技术之一。该技术依赖入射光在不同折射率的两种光学介质表面所产生的穿透极浅的渐逝波来动态观察界面邻近的结构与现象。渐逝场产生的条件是入射介质的折射率大于折射介质的折射率，并且照射光的入射角等于或大于产生全反射的临界值;在这种条件下所产生的渐逝波扩散进入低折射率介质，并且随着扩散深度的增加，其强度呈指数递减。渐逝场荧光显微术利用渐逝波激发荧光物质进行观察，由于渐逝场的穿透极浅，只能在光学表面下小于100 nm的层面以内激发荧光染料，因此几乎完全排除了细胞内的自发荧光干扰，与传统荧光显微术相比，探测灵敏度和图像信噪比大大提高，使观察对象非常清晰。近年来渐逝场荧光显微术在生命科学领域的研究中，尤其是在界面附近探测成像观察中得到了广泛应用。

［1］Fish KN.Total internal reflection fluorescence(TIRF)microscopy.In:Curr Protoc Cytom(Robinson JP Ed.)，John Wiley ＆ Sons Inc，2009;Chapter 12:Unit12，18.

［2］Trache A.Meininger GA.Total internal reflection fluorescence(TIRF)microscopy.In:Curr Protoc Microbiol(Coico R，Kowalik T，Quarles JM，Stevenson B，Ed.)，John Wiley ＆Sons Inc，2008;Chapter 2:Unit 2A.2.1-2A.2.22.

［3］Toomre D.Axelrod D.Total internal reflection fluorescence microscopy.In:CellBiolology，A LaboratoryHandbook(Celis JE Ed.)，3rd edition，Elsevier Inc，Vol.3，2006;19-28.

［4］Axelrod D.Chapter 7:Total internal reflection fluorescence microscopy.In:Methods Cell Biol.(Allen T Ed.)，Elsevier Inc，Vol.89，2008;169-221.

［5］Bowser DN，Khakh BS.Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(10):4212-4217.

［6］Holz RW.Analysis of the late steps of exocytosis:biochemical and total internal reflection fluorescence microscopy(TIRFM)studies［J］.Cell Mol Neurobiol，2006，26(4-6):439-447.

［7］Letinic K，Sebastian R，Barthel A.Deciphering Sub-Cellular Processes in Live Imaging Data Sets via Dynamic Probabilistic Networks［J］.Bioinformatics 2010，26(16):2029-2036.

［8］Mashanov GI，Tacon D，Knight AE，et al.Visualizing single molecules inside living cells using total internal reflection fluorescence microscopy［J］.Methods，2003，29(2):142-152.

［9］Merrifield CJ，Feldman ME，Wan L，et al.Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrincoated pits［J］.Nat Cell Biol，2002，4(9):691-698.

［10］Steyer JA，Almers W.A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2(4):268-275.

［11］Schneckenburger H，Total internal reflection fluorescence microscopy:technical innovations and novel applications［J］.Current Opinion in Biotechnology，2005，16:13-18.

［12］Fu ZY，Wang YP，Chen Y.Observation of insulin exocytosis by a pancreatic β cell line with total internal reflection fluorescence microscopy［J］.Chin Med Sci J，2011，26(1):60-63.

［13］Vale RD，Funatsu T，Pierce DW，et al.Direct observation of single kinesin molecules moving along microtubules［J］.Nature，1996，380(6573):451-453.

［14］Jacobs DT，Weigert R，Grode KD，et al.Myosin Vc is a molecular motor that functions in secretory granule trafficking［J］.Mol Biol Cell，2009，20(21):4471-4488.