基于电子扫描的Image J图像处理系统在多孔材料中的应用*

邓林红，王 锐，陈园园

(重庆大学 生物工程学院，重庆400030)

0 引言

电子扫描显微镜利用电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，能够使物质结构在非常高的放大倍数下成像，得到高分辨率的微观图像，但是这种图像只能提供形态学上的表观差异，无法定量或定性地分析图像的差异。另一方面，细胞和组织与其周围环境密切相关［1］，其中基底拓扑结构更是能直接影响细胞的命运［2，3］。基底拓扑结构已成为当今众多生物传感器和仿生材料调控干细胞命运的重要手段［4，5］。因此，对材料拓扑结构的分析显得尤为重要，而至今仍没有一种行之有效的定性分析不规则多孔材料表面拓扑结构差异的分析方法。本文提出了一种基于扫描电镜的图像处理算法，定性地分析不规则多孔材料表面拓扑结构的差异。

1 实验方法与步骤

1.1 扫描电镜成像

由电子枪发射的电子束经会聚聚焦，在样品表面形成一个具有一定能量和强度的电子束。由于入射电子与样品之间的相互作用，将从样品中激发出二次电子。由于周围传感器的作用可将各个方向发射的二次电子汇集起来，加速射到光电传感器上，使光信号转变成电信号。这个电信号又经视频放大器放大输送至显像管的荧光屏上，从而呈现一幅亮暗程度不同的、反映样品表面形貌的二次电子象。由于它利用电子束代替光束，电子透镜代替光学透镜，因此，它具有很高的分辨率，能够在非常高的放大倍数下得到清晰的物质表面微观图像［6］。

本实验以2种明胶浓度的明胶/羟基磷灰石复合钛植入体材料为研究对象，其扫描电镜图像如图1所示。但是这种图像只能提供形态学上的表观差异，无法定量或定性地分析图像的差异。因此，本文提出了一种基于扫描电镜的图像处理算法，定性地分析不规则多孔材料表面拓扑结构的差异。

1.2 基于扫描电镜的图像处理算法

首先选择相同放大倍数的电子扫描图像，其次预处理将图像按分水岭算法转换成二进制图像，灰度值的范围为0～255，其中0代表黑色表示亮度最低，而255表示亮度最高显示为图像中的纯白色。其中阈值的选择采用全局阈值方法，在阈值选择前，要对所需要处理的图像进行分析实验，一般是采用观察直方图来选择。孔径内部的像素点灰度值比较小，周围的亮度比较大，因此，直方图会有2个波峰，选择2个波峰的中间波谷的灰度值即可作为阈值。在转换之前可适当进行平滑处理以让边界轮廓清晰提高信噪比。最后选用颗粒分析工具提取孔径特征值，诸如面积、圆度等，用高斯拟合曲线对比两者的差异，如图2。

图1 两种明胶浓度的明胶/磷灰石复合钛材料表面扫描电镜图像Fig 1 SEM results of gelatin/hydroxyapatite composite titanium surface with two different concentration of gelatin

图2 Image J图像处理分析孔径特征流程图Fig 2 Flow chart of pore characterization analysis based on Image J processing

1.3 数据分布曲线拟合

将按上述算法得到的孔径特征值在Matlab中进行拟合。根据数据特征的不同，可以进行不同的拟合，如二项分布，多项式分布，正态分布等。由于本实验的研究对象是一个随机的正态分布，因此，进行高斯拟合，如式(1)

高斯分布也称正态分布，有2个参数即均值μ和标准差σ，可记作N(μ，σ):均值μ决定正态曲线的中心位置;标准差σ决定正态曲线的陡峭或扁平程度。σ越小，曲线越陡峭;σ越大，曲线越扁平。

2 结果

2.1 基于扫描电镜的图像处理算法提取孔径边界

从图3中可以看出:(b)是图像(a)经图像处理算法转换之后提取的孔径轮廓，(d)是图像(c)经图像处理算法转换之后提取的孔径轮廓，从中可以看出:基于ImageJ图像处理系统提取的孔径轮廓清晰，精确度高，而且便于后续计算分析。

2.2 孔径特征值数据的曲线拟合

由于本研究对象是一随机过程，可以将基于扫描电镜的图像处理算法提取的孔径特征值概率密度首先做直方图，然后进行高斯曲线拟合。因此，对圆度和面积分别进行高斯拟合，如图4和图5所示。

图3 基于扫描电镜的图像处理算法提取的孔径边界Fig 3 Pore boundary based on SEM image processing algorithm extraction

图4 Image J图像处理提取的孔径面积正态分布拟合图像Fig 4 Gaussian distribution fitting diagram of pore area based on Image J processed

图5 Image J图像处理提取的孔径面积正态分布拟合图像Fig 5 Gaussian distribution fitting image of pore area based on Image J processed

从拟合结果(表1)中可以看出二者的圆度均服从正态分布(记为N(μ，σ))，经过T检验，150 mg/L复合钛的圆度显著大于100 mg/L复合钛(P＜0.05)。而孔径面积分布以1μm2为分界线，呈现2个不同的正态分布。经T检验，面积在小于1μm2时二者无显著差异(P＞0.05)，而在大于1μm2时二者有显著差异(P＜0.05)。因此，本算法系统能够定性分析出材料表面拓扑结构的差异和特征分布。

表1 高斯拟合结果Tab 1 Gaussian fitting results

3 结论

本文基于电镜扫描，结合Image J图像处理算法和曲线拟合的算法系统能定性地分析出多孔材料表面拓扑结构的差异，该方法具有较高精确性，其过程和方法灵活具有广泛的适用性。同时，对于生物多孔材料和纳米材料与生物细胞的关系认识上有重要意义。

［1］Schneider R K，Knuchel R，Neuss S.Mesenchymal stem cells and their interaction with biomaterials:Potential applications in tissue engineering［J］.Pathologe，2011，32(2):296－303.

［2］Mrksich M，Kilian K A，Bugarija B，et al.Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells［C］∥Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010:4872－4877.

［3］McBeath R，Pirone D M，Nelson CM，et al.Cell shape，cytoskeletal tension，and RhoA regulate stem cell lineage commitment［J］.Dev Cell，2004，6(4):483－495.

［4］Martinez E，Engel E，Planell J A，et al.Effects of artificial microand nano-structured surfaces on cell behaviour［J］.Annals of A-natomy-Anatomischer Anzeiger，2009，191(1):126－135.

［5］Liu X，Smith L A，Hu J，et al.Biomimetic nanofibrous gelatin/apatite composite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30(12):2252－2259.

［6］于丽芳，杨志军，周永章，等.扫描电镜和环境扫描电镜在地学领域的应用综述［J］.中山大学研究生学刊，2008，29(1):54－60.