实时荧光定量PCR方法对3种不同标本中巨细胞病毒检出率的比较

余鹃春 王 左 项贵明 吴佳燕

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒科β属，是一种有包膜的双链线性DNA病毒，直径大约 200nm，基因组长约 220～245kb，是人类先天性病毒感染的主要病原，同时也是机体免疫功能低下的人群的常见并发感染的死亡原因，如器官移植以及AIDS病人［1］。CMV感染所致疾病症状和体征等表现是非特异性的，许多CMV感染的病人并不表现出临床症状成为潜在感染状态，必须结合实验室诊断才能诊断［2］。实时荧光定量PCR是一种早期快速的诊断方法，目前临床主要使用血清标本检测，但检出率太低，笔者医院2008～2009年1年间共申请检查HCMV－DNA血清标本810例，检出14例阳性标本，其中肾移植术后8例，血液科5例，呼吸科1例，检出率仅为1．7%，为此笔者对胶体金标免疫层析法检测HCMV－IgM阳性或弱阳性的患者，分别留取血清、晨尿沉渣及外周血中单个核细胞3种临床易获标本，采用实时荧光定量PCR同时进行检测，以期获得一种更适合临床需要的检测标本。

对象与方法

1．研究对象:笔者医院2009年11月～2010年3月HCMV－IgM阳性或弱阳性的患者43例，分别收集这些患者的血清，晨尿和外周血中单个核细胞液标本。同一病人具备3种标本的21例，共有血清标本42例，外周血单个核细胞分离标本43例，尿沉渣标本22例，其中肾移植术后30例，血液科7例，儿科4例，神内皮肤科2例。女性16例，男性27例;患者年龄最小2个月，最大70岁，中位平均年龄36．7岁。

2．标本的采集和处理:在患者知情同意下，用促凝管采集被检者静脉血3ml，4000r/min离心分离血清。收集被检者中段晨尿10ml密封送检，混匀取1ml尿液标本于1500r/min离心10min，弃掉上清，其沉渣用于HCMV－DNA的提取。用被检者静脉血3ml(EDTA抗凝)，使用上海华精生物公司的Ficoll分离液，严格按说明书要求操作，分离提取外周血单个核细胞。

3．HCMV－DNA测定:采用实时荧光PCR方法。试剂盒由深圳匹基公司提供，批号:090801。①标本的提取:取100μl待测标本，加入100μl DNA提取液1(PEG，NaCl)，振荡混匀。13000r/min离心15min，吸弃上清。加入50μl DNA提取液2(Tris．base，KCl，NP40)，振 荡 混 匀。100℃ 干 浴 10min，13000r/min离心10min，保留上清待用;②扩增条件设置:37℃:5min;94℃:1min;95℃:5s，60℃:30s，40 个循环。试剂使用TaqMan探针，荧光信号收集选择FAM检测通道，荧光信号收集选择在60℃;③结果判断:严格按照试剂说明书进行。定性判断标准:CT值≤37．0的样本为阳性;④扩增仪器:基因公司RG3000荧光PCR检测仪。

4．HCMV－IgM测定:胶体金标免疫层析试验。使用康华生物技术有限公司TOCRCH－IgM试剂。

5．统计学方法:3种不同标本中检出率的比较采用χ2检验，以p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

Real－time PCR扩增曲线见图1、图2;扩增结果见表1、表2(S:血清;U:晨尿;M:外周血单个核细胞)。

Real－time PCR检测3种不同标本中HCMVDNA结果见表3。表3中数据显示，患者外周血单个核细胞分离液标本阳性检出率20．93%，晨尿沉渣标本HCMV－DNA阳性检出率为18．18%，都显著高于血清标本阳性检出率4．76%。

表3 实时PCR检测不同标本中HCMV－DNA结果比较

讨 论

目前用实时PCR检测HCMV的临床标本可以有以下几种标本:血清、尿液、外周血单个核细胞分离液、羊水、乳汁，支气管肺泡灌洗液，脑脊液等［3，4］。至今以何种标本作为临床常规检查标本仍有争议，因羊水、乳汁等临床标本数量较少，单从本文所选3种标本检出率来看，外周血中分离的单个核细胞检出率最高、其次是尿液、目前临床开展最广泛的血清检出率是最低的。

HCMV主要侵袭血液有核细胞并在细胞内潜伏或增殖，同时提取外周血中单个核细胞经过了离心浓缩过程，相对提高了病毒浓度，故外周血中单个核细胞检出率高，但由于其操作程序复杂，且受白细胞数量影响较大，对于骨髓移植术后早期白细胞缺乏或使用抗病毒药物影响白细胞数量低时检测将受到限制［5］。刘广印等［6］提出用 NH4Cl裂解红细胞代替淋巴细胞分离液，此法简便易操作，结果可靠，特别适用于常规实验室应用，可向临床实验室推荐使用。

HCMV最易侵犯管道上皮细胞，尤其是肾脏及肝胆系统。CMV在肾小球和肾小管上皮细胞内复制，经尿液排出，因此可在尿液中检测，检出阳性率高［7］。尿液标本中HCMV量可很好反映机体内HCMV病毒量，且取材方便、无创、易为患者接受。对需长期监测HCMV病毒载量的移植病人和小儿患者为最适用标本，不失为理想的临床检测标本。但尿液存在取材可能被污染和CMV感染治愈后仍有排毒现象，易造成假阳性。

HCMV感染机体，侵入细胞后开始增殖，增殖一定程度后可诱发宿主细胞发生凋亡，同时释放出宿主细胞里的病毒，血清里的病毒达到一定数量之后，我们才能检测到血清里的巨细胞病毒，故血清检出率较低。但血清标本的检出能比较好的反映感染的活动性，且有统一的参考范围，可以对疾病有良好的评价。

综上所述，外周血中单个核细胞的HCMVDNA检出率高，检测结果稳定特异，是理想的临床检测标本，同时晨尿沉渣也因其阳性率较高、取材方便、无创、易为患者接受等，也可根据患者情况予以选择，但二者的参考区间是否与血清一致，还有待进一步研究。

1 Soderberg NC．HCMV microinfections in inflammatory diseases and cancer［J］．J Clin Virol，2008，41(3):218 － 223

2 张书红．人巨细胞病毒感染检测方法的研究进展［J］．医学综述，2009，15(22):3495－3497

3 Murata H，Nii R，Ito M，et al．Quantitative detection of HCMV － DNA in saliva from infants and breast milk on real－time polymerase chain reaction［J］．Pediatr Int，2009，51(4):530 －534

4 Xue W，Liu H，Yan H，et al．Methodology for monitoring cytomegalovirus infection after renal transplantation［J］．Clin Chem Lab Med．2009，47(2):177 －181

5 陈俊青，刘霆．巨细胞病毒感染检测方法的现况和进展［J］．中国输血杂志，2005，18(5):428 －431

6 刘广印，周光庭，沈佐君．实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒两种白细胞提取方法对比分析［J］．淮海医药，2007，5(2):95－96

7 Bergallo M，Costa C，Terlizzi ME，et al．Reverse transcriptase－ polymerase chain reaction to evaluate human cytomegalovirus lytic gene expression［J］．Mol Biotechnol，2008，40(2):144 －150