eIF4E和cyclinD1在结直肠癌中的表达和临床意义

朱慧能 张 谷 陈丽荣

真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)是mRNA帽结合磷蛋白，是帽依赖性mRNA翻译过程中的限速因子，在蛋白质合成的起始阶段起重要的调控作用，参与细胞生长调节，并具有抗凋亡活性［1］。近年来研究发现，eIF4E基因又是一种原癌基因，可影响细胞生长和分化，在人类很多恶性肿瘤，例如乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、甲状腺癌及胆管癌等，均发现肿瘤和肿瘤旁组织中eIF4E过度表达并与肿瘤的侵袭、转移能力呈正相关，抑制eIF4E的表达可以减少肿瘤相关基因的表达［2～6］。结直肠癌组织中eIF4E表达水平、生物学意义及其与细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的关系，目前尚不十分明确，国内外相关研究也较少见。本研究旨在探讨eIF4E和cyclinD1在结直肠癌的发生发展中的作用和防治策略上的应用价值。

材料与方法

1．临床资料:收集浙江省肿瘤医院2001年1月～2003年12月收治的80例原发性结直肠腺癌(colorectal cancer，CRC)手术标本，其中男性50例，女性30例，男女性别比例1．67∶1。患病年龄31～82岁，平均年龄60．01岁，中位年龄60岁，每例均有详细的临床病理资料、手术记录及5年以上的随访结果，术前均未接受化疗和放疗。另外收集20例正常结直肠黏膜和30例结直肠腺瘤组织蜡块标本作为对照。组织学分级标准参照S．R．Hamilion和CA．Rubio等主编的2000年WHO消化系统肿瘤分类:高分化:腺样结构＞95%，中分化:腺样结构50% ～95%，低分化:腺样结构＜50%。

2．试剂与方法:全部标本经10%中性甲醛固定。免疫组化标记采用EnVision二步法，步骤:切片常规脱蜡至水;3%双氧水封闭5～10min;蒸馏水洗2min×3;切片浸入Tris－EDTA修复液中，97℃水浴20min;PBS冲洗2min×3;一抗室温孵育1h;PBS冲洗2min×3;二抗室温孵育30min;PBS冲洗2min×3;DAB显色3～5min，蒸馏水终止显色;自来水冲洗，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封固。兔抗人eIF4E单克隆抗体(克隆号C46H6，稀释度1∶200)为美国Cell Signaling Technology公司产品，兔抗人cyclinD1单克隆抗体(克隆号SP4，稀释度1∶100)为福州迈新生物技术开发有限公司产品。抗体的稀释均选用DAKO Antibody Diluent。阳性对照为已知阳性切片，用PBS液代替一抗作阴性对照。

3．结果判定:在高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5个视野，计数200个细胞/视野，共计1000个细胞，以细胞中相应部位出现淡黄色到棕褐色颗粒为阳性细胞，对细胞内反应如下评分:①无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3;②阳性范围:＜5%为0，5% ～25%为1，26% ～50%为2，51% ～75%为3，＞75%为4。两项结果相加＜2为阴性(－)，2～3为弱阳性(+)，4～5为中度阳性(++)，6～7为强阳性(+++)。+～+++均作为阳性表达。

4．统计学方法:用SPSS13．0软件包，组间比较及与临床病理指标的相互关系用χ2检验和Fisher's确切概率法，应用Spearman等级相关检验对eIF4E和cyclinD1在结直肠癌中的相互间关系进行分析，生存率计算应用Kaplan－Meier法，生存曲线比较采用log－rank检验，以p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．eIF4E和cyclinD1蛋白在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和腺癌中的表达。eIF4E阳性着色定位于细胞质(图1～图3)，cyclinD1定位于细胞核(图4～图6)，eIF4E和cyclinD1蛋白在腺癌组和腺瘤组阳性率均高于黏膜组(P均＜0．01)，在腺癌组和腺瘤组，eIF4E和cyclinD1蛋白表达不具有统计学差异(P分别为 0．154、0．436)(表1)。

2．eIF4E和cyclinD1蛋白的表达与结直肠癌临床病理特征的关系:eIF4E蛋白在结直肠癌中的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和5年生存期有显著相关性(p＜0．05)。cyclinD1蛋白在结直肠癌中的表达与组织学分级(p＜0．05)、淋巴结转移和TNM分期(p＜0．01)有显著相关性(表2)。

3．结直肠癌组织中eIF4E和cyclinD1蛋白表达的关系:结直肠癌组织中eIF4E与cyclinD1蛋白表达呈正相关关系(等级相关系数 r=0．914，P ＜0．01)(表3)。

4．eIF4E和cyclinD1蛋白表达与结直肠癌预后的关系:本组80例CRC病例最短生存时间2个月，最长96个月，平均生存期52．83个月，中位生存时间65个月。80例CRC中，eIF4E蛋白阳性表达74例，1、3、5 年生存率分别为 89．2%、63．5%、47.3%，eIF4E阴性表达6例，1、3、5年生存率均为100%，阴性表达组预后好于阳性表达组，差异具有统计学意义(P=0．046)(图7)。80例 CRC中，cyclinD1蛋白阳性表达44 例，1、3、5 年生存率分别为 90．9%、65．9%和47．7%;cyclinD1 阴性表达36 例，1、3、5 年生存率分别为88．9%、66．7%和55．6%，差异不具有统计学意义(P=0．944)(图 8)。

表1 eIF4E和cyclinD1蛋白在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和腺癌中的表达

表2 eIF4E和cyclinD1蛋白的表达与结直肠癌临床病理特征的关系

表3 结直肠癌组织中eIF4E和cyclinD1表达的相关性

讨 论

图7 eIF4E表达与生存率关系，阴性表达组预后明显好于阳性表达组(P=0．046)

图8 cyclinD1表达与生存率系，阴性和阳性表达组生存曲线无显著差异(P=0．944)

eIF4E基因定位于染色体4q21～q25，其碱基序列＞50kb，包括7个外显子，6个内含子。eIF4E基因编码分子质量为25kDa的多肽，以游离或复合物的形式分布于所有真核细胞细胞质，部分位于细胞核［7］。eIF4E可特异性地与真核细胞mRNA的5'末端帽结构(m7GpppN)结合，参与mRNA的翻译，在帽依赖的翻译起始阶段起限制调控作用，是mRNA翻译中最有效的调控节点［8］。正常情况下，由于eIF4E蛋白的有限表达及其与抑制蛋白4E－BPs的结合，具有活性的eIF4E形成是有限的，这些因素造成细胞内mRNA互相竞争与eIF4E结合送至核糖体参与翻译过程，所以eIF4E在蛋白质合成起始阶段起限定作用。此时，编码管家蛋白的“strong mRNAs”的翻译将很快达到最高值而被有效的翻译，而编码控制细胞周期、生长因子自我调控、血管生长、生存和侵袭等相关的蛋白质的“weak mRNAs”不被翻译。当eIF4E高表达时，选择性地加强“weak mRNAs”的翻译，使“weak mRNAs”较好的表达，细胞可能经历畸形有丝分裂和(或)凋亡，导致基因不稳定，并导致细胞癌变［9］。

我们对80例原发性结直肠腺癌以及30例结直肠腺瘤中eIF4E蛋白的检测表明:在结直肠腺瘤和腺癌中eIF4E蛋白的表达水平均较高(阳性率分别为83．3%和92．5%)，与正常结直肠黏膜(阳性率为10%)相比较组间差异均具有统计学显著意义(p＜0．01)。因此，我们认为eIF4E蛋白表达上调可发生在从腺瘤到进展期腺癌的结直肠癌发展的全过程，提示其在结直肠癌的发生发展中是一种早期事件。eIF4E在结直肠癌中的表达与临床病理参数和预后的关系日益被国内外学者关注，已有的研究显示，eIF4E表达水平与组织类型、肿瘤分期、浸润深度有关［10，11］。本组 80 例结直肠癌的研究结果显示:eIF4E蛋白的表达在浆(外)膜外浸润组(阳性率100%)高于浆(外)膜内浸润组(阳性率85．4%)，淋巴结转移组(阳性率100%)高于无淋巴结转移组(阳性率85%)，5年死亡组(阳性率100%)高于5年生存组(阳性率85．7%)，差异均具有统计学意义(p＜0．05)。提示eIF4E高表达可能与肿瘤的浸润、转移等进展相关，可作为临床上结直肠癌的预后评价指标。鉴于本组病例数有限，有待今后更多样本的研究进一步证实。

cyclinD1编码基因CCNDI定位于人染色体11q13，全长15000bp，有5个外显子，编码由295个氨基酸残基组成的蛋白质，分子质量36kDa，即cyclinD1蛋白。在正常组织中，cyclinD1蛋白水平通常较低，在有丝分裂原或生长因子存在的情况下，cyclinD1蛋白可持续表达。表达的cyclinD1蛋白与CDK4/6结合，激活CDK4/6的蛋白激酶活性，再与pRb结合，启动S期相关基因的转录，促进DNA的合成，加快细胞由G1期进入 S期，导致细胞生长失控和肿瘤发生［12］。本研究结果显示 cyclinD1蛋白在结直肠黏膜、腺瘤和结直肠癌中的阳性率分别为0%、46．7%，55%，结直肠黏膜和结直肠癌组间差异具有统计学显著意义(p＜0．01)。cyclinD1在结直肠癌中的表达与组织学分级(p＜0．05)、淋巴结转移和TNM分期(p＜0．01)有显著相关性;而与性别、年龄、肿瘤部位、肿块大小、肿瘤浸润深度、有无瘤栓及5年生存率等均无显著相关性(P＞0．05)，与文献报道基本一致。提示cyclinD1与结直肠癌发生和进展有关。

本研究对80例结直肠癌的eIF4E与cyclinD1蛋白表达相关性分析表明:两者在结直肠癌的表达呈正相关关系，eIF4E高表达可能导致cyclinD1表达水平增高，提示两者在结直肠癌的发生、发展过程中存在协同关系。这不仅有助于深入认识eIF4E致癌的分子机制;而且，可通过抑制或降低eIF4E表达水平来降低cyclinD1等癌基因表达，从而抑制结直肠癌细胞增殖，这将是很好的抗肿瘤策略，可能具有良好的应用前景。

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