乳酸菌细菌素作为天然生物防腐剂在食品工业中的应用进展

刘国荣， 李平兰， 王成涛

(1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心/食品风味化学 北京市重点实验室，北京 100048; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

乳酸菌细菌素作为天然生物防腐剂在食品工业中的应用进展

刘国荣1，2， 李平兰2， 王成涛1

(1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心/食品风味化学 北京市重点实验室，北京 100048; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中合成的天然抑菌多肽或蛋白质，由于其对食品腐败菌和致病菌的强烈抑菌活性，已成为天然食品生物防腐剂研究与开发的热点.对乳酸菌细菌素在食品工业中的应用研究作了全面系统的综述，并指出了目前存在的主要问题和今后的研究方向.

乳酸菌细菌素;天然生物防腐剂;食品工业

食品在加工和保藏过程中，极易受到微生物污染而导致腐败变质，采用防腐剂抑制微生物，延缓腐败是当今食品保鲜的重要技术之一.据不完全统计，世界上约有20%的粮油食品因霉变、腐败而被浪费掉，同时它还严重危及了人类健康，如在美国，由沙门氏菌之类的致病菌引发的食源性疾病每年造成7 000人死亡，2 400万～8 000万人的肠胃中毒，直接经济损失高达50亿～170亿美元.因而进行食品防腐保鲜是保障食品安全的重要手段［1］.然而，食品中使用最多的是化学防腐剂，影响人体健康，它的应用越来越受到众多国家的限制.天然生物防腐剂具有安全、无毒、适用性广、性能稳定等优点，因此，开发天然食品生物防腐剂已成为现代食品工业的重要任务.

乳酸菌及其活性代谢产物与人类的健康密切相关，常常被有意识地引进食品产品或自然地发生在食品中，从而使食品拥有人们渴望的风味、结构、营养及健康的特征.乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内可被降解，具有无毒、无残留、高效、耐酸、耐高温、无抗药性等特点，目前已成为天然防腐剂研究与开发的热点［2－3］.

近年来，有许多学者进行了乳酸菌细菌素在食品、饲料、生物制药中的应用研究，取得了大量的研究成果.本文重点对近年来乳酸菌细菌素在食品工业中的应用进展进行了综述.

1 乳酸菌细菌素在食品中的应用概况

乳酸菌产生的细菌素具有以下的特点，使得其成为食品天然防腐剂开发对象.1)细菌生长繁殖快，生产周期短，适合工业化生产;2)具有较好的稳定性，适合食品加工处理，使用方便;3)能被人体内的蛋白酶降解，不在体内蓄积，不会对肠道正常菌群有影响;4)不会产生耐药性，不会诱发食品病原菌等微生物对治疗用抗生素的抗性;5)便于利用现代基因工程技术对细菌素基因进行修饰和改造［4］.

目前，乳酸菌细菌素作为食品防腐剂在食品中的应用方式主要有以下4种.1)直接添加细菌素到食品中或以细菌素产生菌作为发酵剂生产发酵食品;2)开发制备包含细菌素的食品包装袋或保鲜膜;3)在用于食品发酵的微生物中表达外源细菌素基因;4)基于细菌素栅栏技术的应用［5］.

2 直接添加乳酸菌细菌素到食品中

目前，在食品中已经广泛使用的乳酸链球菌素(nisin)，正是直接添加乳酸菌细菌素到食品中这种投放模式的极好例子.而细菌素产生菌作为发酵剂或者辅助培养物、保护性培养物添加到食品中，既可以避免细菌素较为繁琐的纯化程序，又可以利用乳酸菌发酵产生的其他抑菌物质来提高细菌素的抑菌活性，改善产品的品质，延长货架期，也是较为经济的投放模式.现在许多研究也已证明，产生细菌素的发酵剂在发酵过程中可以防止或抑制不良菌的污染，因而将产细菌素的乳酸菌加入到食品中比直接添加细菌素更好.另外，以更易于接受的方式或在较低投入的情况下，将细菌素或者产生菌作为一种食品成分添加到食品中，如ALTA 2341和FARGO 23(纯天然多功能的片球菌发酵食品成分，含有天然的代谢产物包括有机酸和片球菌素)［6］.

产细菌素戊糖乳杆菌31-1，分离自我国传统发酵肉制品宣威火腿，其所产细菌素pentocin 31-1对单增李斯特氏菌(Listeria monocytogene)有强烈抑制效果，且有较好食品加工耐受特性.本课题组前期将pentocin 31-1添加到托盘包装的冷却猪肉中，并从微生物、理化指标、感官品质三个方面综合评价pentocin 31-1对冷却肉的防腐保鲜效果，结果发现，在冷却猪肉的储藏过程中，pentocin 31-1的添加可以明显延长冷却肉的货架期，抑制挥发性盐基氮含量升高，降低微生物生长速率，尤其是可以强烈抑制假单胞菌和潜在致病菌李斯特氏菌的生长.并确定添加80 AU/g pentocin 31-1的保鲜效果最好，可将托盘包装冷却猪肉的保质期延长至15 d，并保持良好的感官特性.这些结果都显示了该细菌素具有作为天然生物防腐剂应用于冷却肉制品中的潜力［7－8］.

在此基础上，本课题组还探讨了产细菌素戊糖乳杆菌31-1作为发酵剂菌株在发酵香肠生产中的工业适应性，以期开发具有生物防腐功能的新型肉品发酵剂.对比商业发酵剂菌株，利用菌株31-1生产发酵香肠，可提高乳酸菌竞争优势，加速香肠发酵;同时降低有害微生物数量，增加食品安全.此外，还可显著提高游离氨基酸和游离脂肪酸的含量，赋予终产品具有很好的感官品质和总体可接受性，显示出了该菌株作为新型功能型发酵剂生产发酵香肠的巨大应用前景［9］.

3 开发制备成食品包装袋或保鲜膜

开发制备包含乳酸菌细菌素的食品包装袋或保鲜膜是近年来国际上较为流行的一个细菌素应用研究方向，目前国内相关研究几乎为空白.这种应用方式的最大优点是可使乳酸菌细菌素在食品保藏过程缓慢释放，最大程度延长细菌素的活性发挥时间.已有部分研究学者通过此方式取得了较为理想的研究成果，如Ercolini等［10］把细菌素涂布到包装薄膜上，并对细菌素的活性进行了研究，发现其能有效抑制与薄膜直接接触的、食品表面的李斯特氏菌(Listeria spp.)的生长.Franklin等［11］用含有 nisin的包装纸包装热狗，在60 d的观察中发现，热狗表面李斯特氏菌数量比普通包装纸中的明显降低.Mauriello等［12］用弯曲乳杆菌(L.curvatus)32Y所产细菌素通过浸泡、喷涂、涂层3种不同的方法处理了塑胶包装膜.在4℃条件下，用这些薄膜包装的猪肉、牛排和牛肉表面的李斯特氏菌数量很少，货架期明显延长.Jin等［13］采用含有nisin的聚乳酸材料包装橙汁和液体蛋清，结果发现nisin能够均匀地分布于聚乳酸表面，并对E.coli O157:H7，L.monocytogene和Salmonella都有较强的抑制作用.这些结果都说明，运用高分子物质与细菌素结合材料来进行食品保藏具有广阔的前景.

4 基于异源表达技术的应用

实际生产中，很多因素会限制这类细菌素的有效性，如基因不稳定性、抑菌活性的消失、敏感细胞抗性的出现等.而且并不是所有的工业微生物都可以产生细菌素，而产生细菌素的菌株也并不一定适应细菌素发挥作用的环境.因此，近年来有许多学者尝试通过将细菌素基因导入不产生细菌素的工业菌株中而使其获得细菌素产生的能力，既可以保证食品质量，又可以抑制食品中的腐败菌和病原菌，提高食品安全性［2，14］.通过异源表达可以:1)提高细菌素的产量，以便进行细菌素的作用模式、结构与功能及应用性研究;2)减少在目标细胞中细菌素抗性的发生，提高其在食品中的抗菌效率;3)在更安全的宿主中生产细菌素;4)构建出对多种不良微生物都有抑菌活性的细菌素产生菌;5)构建出对食品环境有更好适应性的重组宿主;6)为乳酸菌提供更好的抗菌特性，使其在作为食品发酵剂、益生菌制剂、饲料添加剂等时能更好地发挥作用［15］.总之，异源表达技术将为乳酸菌细菌素作为天然生物防腐剂在食品工业中的应用提供崭新的发展方向.

目前，可用于乳酸菌细菌素异源表达的系统主要有大肠杆菌表达系统、乳酸菌表达系统及酵母菌表达系统，其中大肠杆菌表达系统的相关研究最多，但是大肠杆菌菌株本身不具有食品应用特性，因此仅表达产物可用于食品工业，有一定的局限性.与大肠杆菌表达系统相比较，食品级乳酸菌和酵母菌表达系统获得相对困难，但是这些菌本身安全且能够将目的蛋白分泌到胞外，可放心应用于食品工业化生产［15－16］.

本课题组前期建立了肠球菌素enterocin P在食品级乳酸乳球菌中的异源分泌与表达系统，以nisI作为食品级选择标记，将enterocin P基因克隆至食品级表达载体pLEB590并电转化至乳酸乳球菌MG 1614中，组成型表达了具有生物抑菌活性的enterocin P，该研究结果不但拓展了乳酸乳球菌食品级表达载体的应用范围，而且为开发产细菌素的工业化发酵剂、益生菌制剂等奠定了坚实基础.这是国内外首次建立enterocin P在乳酸乳球菌中的异源表达系统，与同类文献相比，其采用的所有表达元件均为食品级［16－18］.目前，正在尝试将 enterocin P 基因导入不产细菌素的发酵剂乳酸乳球菌菌株中而使其获得产细菌素的能力，使其既可发酵食品，又可抑制食品中的腐败菌和病原菌.

5 基于栅栏技术的应用

栅栏技术是将许多不同的防腐保藏技术联合应用以抑制微生物的生长.已有研究报道，两种不同的乳酸菌细菌素联合使用，或者乳酸菌细菌素和其他防腐技术结合，都可以作为栅栏技术应用于食品加工和贮藏过程中，来有效抑制有微生物引起的食品腐败［19－20］.如，乳酸菌细菌素与化学防腐剂的联合使用，既可以提高抗菌活性又可减少化学防腐剂的使用［6］.目前已报道可与乳酸菌细菌素联合使用的其他防腐技术包括:1)化学防腐剂，如柠檬酸钠、乳酸钠、双乙酸钠等;2)物理杀菌技术，如热处理、冷处理等;3)非热力杀菌技术有高压脉冲电场(pulsed electric field，PEF)、超高压(high hydrostatic pressure，HHP)、真空包装等;4)酶制剂，如溶菌酶等;5)金属螯合剂，如EDTA、三磷酸钠(sodium tripolyphosphate，STPP);6)其他，如月桂酸甘油酯等.这些技术与乳酸菌细菌素联合使用可以增加细胞膜的通透性从而增强细菌素的抑菌效果.革兰氏阴性菌通常对乳酸菌细菌素不敏感，而当乳酸菌细菌素与金属螯合剂或物理杀菌技术联合使用时，可以破坏革兰氏阴性菌的细胞膜，使细菌素更容易进入细胞并发挥其抑菌作用，大大提高细菌素抑菌效果［3］.除此之外，这些技术的有效组合还可大大减少乳酸菌细菌素耐受菌株的出现，并最大程度地保持食品良好的感官特性.表1为乳酸菌细菌素在栅栏技术中应用的成功例子.

表1 乳酸菌细菌素在栅栏技术中的应用Tab.1 Application of bacteriocins as a part of hurdle technology to control pathogen and spoiling microbiorganisms in foods

续表1

乳酸菌细菌素由于其高效、安全、无毒、可被人体消化等优点，使其成为天然生物防腐剂的研究热点，但是它们只对革兰氏阳性菌有非常强烈的抑制作用，而对革兰氏阴性菌几乎没有抑制作用或抑制作用很弱.超高压处理(HHP)是目前比较流行的非热力杀菌技术，但是有研究报道，当HHP压力在600 MPa以上时，不仅会一定程度上加速产品脂肪氧化、影响食品的感官特性;而且会加快超高压设备磨损、增加设备的制作和使用成本，制约HHP的商业应用推广［35－36，38］.为了在较低超高压压力下仍获得较强的杀菌效果并增强乳酸菌细菌素对革兰氏阴性细菌的抑菌作用，本课题组前期研究中将细菌素和超高压技术联合使用并考察其对低温切片火腿的防腐保鲜效果.通过此方法，一方面可以降低超高压的施压压力，另一方面可以通过HHP增加革兰氏阴性菌的细胞膜渗透性，从而增强细菌素对其的抑制效果.研究结果发现，在不添加任何化学防腐剂的情况下，enterocin P和超高压技术的联合使用可明显延长低温切片火腿的货架期，有效减少贮藏过程中挥发性盐基氮的生成及脂肪氧化，并保持产品原有色泽、气味、质构等感官特性.综合微生物、理化及感官特性分析，确定添加2 560 AU/g enterocin P，且经400 MPa超高压处理10 min的处理效果最好，可将产品货架期延长到90 d以上［37，16］.该研究结果预示乳酸菌细菌素和超高压联合处理在低温肉制品防腐保鲜中有巨大应用前景.

6 小结与展望

从乳酸菌细菌素的应用现状可以看出，制约其在食品工业中开发与应用的主要因素有:1)天然合成细菌素的产量过低，而且有些细菌素基因由质粒编码，产量不稳定;2)提取过程繁琐，高纯度细菌素制品的制备困难;3)除nisin外，其他新型细菌素缺少安全性评价认证.除需解决以上瓶颈外，未来还可以进行以下几个方面的探索研究.

6.1 具体食品环境对乳酸菌细菌素抑菌效果的影响

由于食品基质和环境，以及其他物质等因素都可能会对乳酸菌细菌素防腐效果产生影响，因此，有待进一步系统地研究食品基质和理化环境、微生物菌群以及其他添加物质等对乳酸菌细菌素抑菌效果的影响，为将来乳酸菌细菌素作为新型生物防腐剂用于食品防腐保鲜奠定基础.

6.2 乳酸菌细菌素与其他防腐技术的协同作用机制

很多研究结果已经发现乳酸菌细菌素与其他一些防腐技术如HHP等存在协同作用现象，但是它们之间的作用机制还不清楚，有待于进一步研究.

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(责任编辑:王 宽)

Advances on Application of Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria as Natural Bio-preservative in Food Industry

LIU Guo-rong1，2， LI Ping-lan2， WANG Cheng-tao1
(1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients/Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Bacteriocins were antibacterial activity protein or peptide produced by lactic acid bacteria，and they were identified with great potential as natural food bio-preservative because of their strongly antibacterial activity against food borne pathogens and spoilage organism.In this review，the development of the application of bacteriocin as preservative in food industry was reviewed.The existing problems and future research consideration were pointed out.

bacteriocins;natural bio-preservative;food industry

TS201.6

A

1671-1513(2012)02-0064-06

2011-11-04

国家自然科学基金资助项目(30671482);北京市教委科技面上项目(KM201110011001);北京工商大学青年教师科研启动基金项目(QNJJ2011-042).

刘国荣，女，讲师，博士，主要从事食品微生物学方面的研究;

李平兰，女，教授，博士，主要从事乳酸菌及其活性代谢产物方面的研究.通讯作者.