大孔树脂纯化山茱萸黄酮工艺研究

朱会霞，孙金旭，张冰喆，李志涛，周成铭，陈尧，林高强

（1.衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000；2.河北省产品质量监督检验院，河北 石家庄 050091）

大孔树脂纯化山茱萸黄酮工艺研究

朱会霞1，孙金旭1，张冰喆2，李志涛1，周成铭1，陈尧1，林高强1

（1.衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000；2.河北省产品质量监督检验院，河北 石家庄 050091）

采用大孔树脂对山茱萸黄酮进行分离纯化，确定其分离纯化条件，树脂的筛选实验结果和静态吸附动态学研究表明，所选的4种大孔树脂，AB-8树脂属于快速吸附树脂，吸附率和解吸率都很高，是理想用于山茱萸黄酮分离纯化的树脂，AB-8树脂动态吸附、解吸实验表明，当上样流速2.0mL/min，上样浓度为1.0mg/mL，上样量70mL，用1.5 mL/min的60%的乙醇做解吸剂进行解吸时，山茱萸黄酮纯度可达到67.38%，具有一定的应用价值。

山茱萸；黄酮；纯化；AB-8

山茱萸俗称山萸、药枣、肉枣等，富含山茱萸多糖、黄酮、熊果酸、没食子酸、苹果酸、酒石酸及维生素等活性成分，是一种名贵的药用植物[1]，许多药理研究证明，它具有补肾益精、涩精固脱、抗菌利尿、降糖降压的功效[2]。随着现代医药科技的飞速发展，延缓衰老、健康长寿已为广大人民群众日益期盼，名贵中药材山茱萸因含有丰富的营养和珍贵的保健成分以及微量元素日益成为科学研究热点。

大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂。它具有比表面积较大、交换速度较快、机械强度高、对被提取物污染小、热稳定好等特点[3]。与其它分离技术相比，它具有提高有效成分的相对含量、产品不吸潮、生产周期短、树脂再生方便、可重复使用等优点，因而近几年在天然产物的分离纯化中被广泛应用，尤其适用于黄酮类化学物的分离纯化[4-5]。本实验采用大孔树脂对山茱萸总黄酮进行分离纯化，确定其分离纯化条件，为工业化生产提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山茱萸：购自河北省衡水市中医药店；试剂：均为分析纯；树脂：AB-8，NAK-9，D101，D4020天津市南大和成树脂厂；芦丁对照品：国家标准物质网；层析柱26 mm×146 mm；722型光栅分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供试液的制备

山茱萸→粉碎、过筛→乙醇提取→抽滤→减压蒸发成膏状→加水溶解→乙酸乙酯萃取→分液→旋蒸→乙醇溶解→备用

1.2.2 检测方法标准曲线的回归方程

准确称取芦丁对照品0.1 g定容至100 mL，吸取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液l mL摇匀，放置6 min；加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。用空白溶剂同法作空白，分光光度法在526 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为A=4.9256C-0.0042，R2=0.9997。

1.2.3 树脂的预处理

用2倍体积的95%乙醇浸泡树脂24 h溶胀，然后用95%乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊，再用去离子水洗尽醇，转入酸碱处理，用体积分数5%HCl溶液浸泡24 h，然后用去离子水洗至pH为中性，接着用体积分数5%的NaOH溶液浸泡24 h，最后用去离子水洗至pH为中性，浸泡于去离子水中备用。

1.2.4 树脂的选择

根据吸附率、解吸率的测定，同时考察树脂的静态吸附动力学特性，从4种树脂中选出较理想的树脂。

1.2.4.1 吸附率、吸附量和解吸率的测定

称取已处理好的4种湿树脂各1 g，加入浓度为1.4 mg/mL的山茱萸黄酮上柱液50 mL，在摇床上以100 r/min的频率振摇24 h后，测定吸附液中黄酮的浓度，计算吸附率和吸附量。

式中：C0为吸附前样液中黄酮的浓度，（mg/mL）；C1为吸附后上清液中黄酮的浓度，（mg/mL）。

式中：V为溶液体积，mL；W为树脂质量，g。去除吸附液后，将树脂加入70%的乙醇溶液100 mL，摇床上以100 r/min的频率振摇24 h后，测定解吸液中黄酮的浓度，计算树脂解吸率。

式中：C0为吸附前样液中黄酮的浓度，（mg/mL）；C1为吸附后上清液中黄酮的浓度，（mg/mL）；C2为解吸液中黄酮的浓度，（mg/mL）。

1.2.4.2 静态吸附动力学特性实验[6]

取大孔吸附树脂1.0 g（用滤纸吸干）装入三角瓶，精密加入山茱萸黄酮提取液50 mL。摇床转速100 r/min，振荡10 h，每小时取1 mL，测定黄酮含量，绘静态吸附动力学曲线。

1.2.5 动态吸附工艺参数的确定

1.2.5.1 吸附流速的确定

将树脂以径高比1∶6装柱，在上柱液浓度和上柱量一致的情况下，改变吸附流速（1.0、2.0、3.0 mL/min）进行动态吸附，每流出10 mL流出液收集并测定有效成分浓度。以流出液体积为横坐标，流出液黄酮浓度为纵坐标，绘制曲线。流出液黄酮浓度占进口黄酮浓度的百分比为泄漏率，当泄漏率为10%即为泄漏点，此时为吸附终点。根据泄漏点的定义在泄漏率曲线中找出合适的吸附速率。

1.2.5.2 上柱液浓度的确定

将树脂以径高比1∶6装柱，取100 mL不同浓度上柱液，分别在最佳流速下通过树脂柱，进行动态吸附，计算吸附率和总吸附量。根据吸附率及总吸附量的变化，综合分析，确定最佳的上柱液浓度。

式中：C0为吸附前样液中黄酮的浓度，（mg/mL）；C1为吸附后上清液中黄酮的浓度，（mg/mL）；V为溶液体积，mL。

1.2.5.3 上柱量的确定

取不同体积的上柱液，通过树脂柱进行动态吸附。每处理1 BV的流出液进行收集并测定黄酮的浓度。以流出液体积为横坐标，流出液浓度为纵坐标作图。根据泄漏点出现快慢来确定上柱量。

1.2.5.4 解吸剂浓度的确定

取适宜浓度、适宜量的上柱液，在适宜的吸附流速下动态吸附后，用不同浓度的乙醇作为解吸剂在相同解吸流速下进行解吸，每10 mL解吸液收集测定黄酮浓度，并计算解吸率。

式中：V1为解吸液浓组分体积，mL；C1为解吸液浓度，（mg/mL）；V0为上柱液体积，mL；C0为上柱液浓度，（mg/mL）。

1.2.5.5 解吸流速的确定

取适宜的上柱液，在适宜的吸附流速下动态吸附后，用不同浓度的乙醇作为解吸剂在不同解吸流速下进行解吸，并计算解吸率。

1.2.6 山茱萸黄酮纯度测定[7]

取山茱萸黄酮提取液，测其吸光度值，带入回归方程计算相应的黄酮浓度，再乘以提取液体积得产品中总黄酮质量，记为A，然后将该提取液在电恒温干燥箱中干燥，得到产品干燥后的质量，记为B，按下式计算黄酮纯度：

2 结果与讨论

2.1 树脂的选择

2.1.1 几种树脂吸附率、解吸率的测定

称取已处理好的4种湿树脂各1 g，加入浓度为1.4 mg/mL的黄酮上柱液50 mL，在摇床上以100 r/min的频率振摇24 h后，测定吸附液中黄酮的浓度，计算吸附率和解吸率，结果如图1、2、3所示。

由图1、2可知，所选的几种吸附树脂对山茱萸黄酮的吸附及解吸率不同，吸附率实验中，AB-8树脂的吸附率达到79%，优于其他3种树脂，解吸率实验中，AB-8树脂的解吸率高于其他3种树脂，达到88%，说明AB-8树脂对山茱萸黄酮有较好的吸附和解吸性，AB-8树脂属于弱极性大孔吸附树脂，此树脂的吸附率较大，说明粗提液中的黄酮主要是弱极性成分。

2.1.2 AB-8树脂吸附山茱萸黄酮静态吸附动力学特性

取已处理好的AB-8树脂1.0 g（用滤纸吸干）装入三角瓶，精密加入山茱萸黄酮提取液50 mL。摇床转速100 r/min，振荡10 h，每小时取1 mL，测定黄酮含量，绘静态吸附动力学曲线，结果如图4所示。

由图4可知，AB-8树脂对山茱萸黄酮的静态吸附，在0～5 h，吸附量呈对数增长趋势，5 h后，吸附量变化不大，说明AB-8树脂对山茱萸的静态吸附较快，5 h时基本达到饱和。

2.2 AB-8树脂动态吸附工艺参数的确定

2.2.1 吸附流速的确定

AB-8树脂以径高比1∶6装柱，上柱黄酮浓度为1.4 mg/mL，上柱量为100 mL，改变吸附流速（1.0、2.0、3.0 mL/min）进行动态吸附，每流出10 mL流出液收集并测定有效成分浓度。以流出液体积为横坐标，流出液黄酮浓度为纵坐标，绘制曲线，结果如图5所示。

由图5可知，流速为1.0、2.0、3.0 mL/min时，泄漏点分别在90、70、50 mL时出现。吸附流速增大时泄漏率呈增大趋势，流速小时，黄酮与固定相之间作用的时间较长，吸附作用的几率较大，吸附效果好，但流速过慢，周期长，效率低。综合考虑，选择2mL/min为适宜吸附流速。

2.2.2 上柱液浓度的确定

将AB-8树脂以径高比1∶6装柱，取100 mL浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL的上柱液，分别在3.0 mL/min流速下通过AB-8树脂柱，进行动态吸附，计算吸附率和总吸附量结果如图6所示。

由图6可知，相同上柱量，不同浓度的山茱萸黄酮提取液，AB-8树脂的吸附率随山茱萸黄酮提取液浓度的增加而降低，而吸附量随黄酮提取液浓度的增加而增加。上柱液浓度越大，总吸附量增大同时树脂就越容易饱和，从而降低了吸附率。实际中，既要考虑吸附量又要考虑吸附率，综合考虑，选择山茱萸提取液上柱液浓度1.0 mg/mL。

2.2.3 上柱量对AB-8树脂吸附山茱萸黄酮的影响

取一定体积上柱液，通过AB-8树脂柱进行动态吸附。上柱浓度1.0 mg/mL流速2.0 mL/min，每处理10 mL的流出液进行收集并测定黄酮的浓度。以流出液体积为横坐标，流出液浓度为纵坐标作图，结果如图7所示。

当流出液中黄酮浓度达到上柱液浓度的10%时，称为漏点，由图7可知，随流出体积的增加，流出液中黄酮的浓度呈增加的趋势，当上柱量为70 mL时，流出液中黄酮浓度达到0.1 mg/mL，为漏点，研究中发现，如果上柱量过大，即一次处理的料液量过多，就会导致解吸峰变宽，解吸物的纯度也会随之降低，并且也会给树脂的再生造成一定的困难。所以上样体积控制在70 mL为宜。

2.2.4 流动相解吸剂浓度的确定

取适宜浓度、适宜量的上柱液，在适宜的吸附流速下动态吸附后，用10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%（体积分数）乙醇解吸剂在相同解吸流速下进行解吸，每10 mL解吸液收集测定黄酮浓度，并计算解吸率，结果如图8所示。

由图8可知，随乙醇浓度的增加，山茱萸黄酮的解吸率逐渐升高，当乙醇浓度为60%时，解吸率达到最大为78%，之后随乙醇浓度的提高，山茱萸黄酮解吸率有所下降，所以60%（体积分数）为山茱萸黄酮适宜流动相浓度。

2.2.5 乙醇流速对山茱萸黄酮解吸率的影响

取适宜的上柱液，在适宜的吸附流速下动态吸附后，用60%（体积分数）浓度的乙醇作为解吸剂在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min下进行解吸，并计算解吸率，结果如图9所示。

解吸是一个解吸剂与树脂竞争作用的过程，解吸过慢，生产周期也会延长；而解吸过快，解吸剂在还没有来得及将被吸附在树脂颗粒上的物质带走，就已经离开了树脂颗粒。因此，解吸速度过慢或者过快都不利于解吸。图9结果表明，60%乙醇以1.5 mL/min的流速进行解吸时，解吸率较高。

2.3 山茱萸黄酮纯度检测

按纯度检测方法，经计算，原山茱萸提取液中黄酮纯度为8.66%，经AB-8树脂纯化后黄酮纯度为67.38%，是原纯度的7.78倍，说明大孔树脂技术可以用于山茱萸黄酮的分离纯化工艺中。

3 结论

在所选的4中树脂中，AB-8树脂属于快速吸附树脂，吸附率和解吸率都较高，用于山茱萸黄酮的纯化较理想，分离纯化山茱萸黄酮的最佳条件为：上样流速2.0 mL/min，上样浓度为1.0 mg/mL，上样量70 mL，用1.5 mL/min的60%的乙醇做为解吸剂进行解吸，纯度测定结果表明，经AB-8树脂纯化后，山茱萸黄酮的纯度为67.38%，具有一定的应用价值。

[1]向继明,丁楠,姜立春,等.山茱萸总黄酮提取工艺的研究[J].农产品加工,2007,11(3):75-77

[2]孙金旭,朱会霞,王敏,等.山茱萸保健啤酒的研制[J].酿酒科技,2007,11(4):56-59

[3]于智峰,王敏.大孔吸附树脂在黄酮类化合物分离中的应用[J].中药材,2006,29(12):1380-1382

[4]何伟,李伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用[J].南京中医药大学学报,2005,21(2):134-136

[5]李伯庭,王湘,李小进.大孔吸附树脂在天然产物分离中的应用[J].中草药,1999,21(8):42-44

[6]杨芙莲，夏银，任蓓蕾.大孔树脂对甜荞麦壳类黄酮的纯化研究[J].食品科技,2009,34(1):135-139

[7]周桃英,罗登宏,李国庆,等.AB-8大孔树脂纯化荷叶总黄酮的工艺研究[J].中国食品添加剂,2009,9(6):114-119

The Study on the Purification of Cornus Flavonoids Using Macroporous Resin

ZHU Hui－xia1，SUN Jin－xu1，ZHANG Bing－zhe2，LI Zhi-tao1，ZHOU Cheng－ming1，CHEN Yao1，LIN Gao－qiang1
（1.Department of Biology，Hengshui College，Hengshui 053000，Hebei，China；2.Hebei Province Institution of Supervision and Inspection Product Quality，Shijiazhuang 050091，Hebei，China）

Using macroporous resin dogwood flavonoids were isolated and purified to determine their separation and purification conditions.Experimental results and the selection of resin adsorption dynamics studies showed that in the selected 4 macroporous resin，AB－8 resin were rapidly adsorbed resin.The adsorption rate and desorption rate were high.They were ideal for the separation and purification of the resin dogwood flavonoids.AB－8 resin dynamic adsorption，desorption experiments showed that when the sample flow rate 2.0 mL/min，the sample concentration was 1.0 mg/mL，the sample volume 70 mL，with 60%ethanol 1.5 mL/min do desorption agents，the dogwood flavonoids up to 67.38 percent purity，had a certain value.

macrocarpium officinale；flavone；purification；AB－8

河北省科学与发展指导性课题，课题编号（07215655）；衡水学院立项课题

朱会霞（1977—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：微生物、发酵工程、食品等方面。

2011-04-17