蕨根黄酮类化合物提取工艺研究

张超，尹礼国，徐洲，魏琴

（宜宾学院生命科学与食品工程学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000）

蕨根黄酮类化合物提取工艺研究

张超，尹礼国，徐洲，魏琴

（宜宾学院生命科学与食品工程学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000）

探索蕨根黄酮类化合物的提取工艺。单因子试验表明，粉碎度、溶剂种类与浓度、浸提时间、温度、液料比等因素对黄酮类化合物提取的影响明显。正交试验表明，浸提溶剂浓度、浸提时间、温度、液料比4个因素中，液料比对黄酮类化合物浸出率的影响最大，其次是乙醇的浓度、浸提温度，提取时间对黄酮类化合物浸出率的影响最小。在70℃条件下，以70%（体积分数）乙醇作为提取剂，液料比为25∶1，回流浸提120min，蕨根黄酮类化合物提取量达到54.12mg/g。

蕨根；回流浸提；黄酮类化合物

凤尾蕨科植物蕨（Pteridium aquilinum L.）是多年生草本植物，主要分布在热带、亚热带和温带[1]。蕨根是蕨的根茎，蕨根除含有丰富的淀粉外[2]，还富含黄酮类化合物等生物活性物质[3]。

黄酮类化合物是指具有C6-C3-C6基本结构的天然产物，大部分是色原酮的衍生物，根据两端苯环与中间三碳的连接方式、位置、直连或环及其氧化水平，衍生而成的一大类化合物。黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化和雌激素样的作用[4-8]。黄酮类化合物广泛存在于植物中，主要有黄酮和黄酮醇、二氢黄酮和二氢黄酮醇、异黄酮和二氢异黄酮、查耳酮和二氢查耳酮类、橙酮类、花色素和黄烷醇类、其他黄酮类七大类。因植物种类不同，其所含黄酮类化合物的组成成分也各不相同，性质各异[9]。因此，提取不同植物的黄酮类化合物的方法及参数也有差异。本文探讨了蕨根黄酮类化合物的提取方法和相关工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蕨根

采自宜宾学院校园内。

1.1.2 化学试剂

乙醇、甲醇、石油醚（30℃～60℃）、乙醚：广东汕头市西陇化工厂；乙酸乙酯：天津市北方化玻采购销售中心；丙酮：成都市联合化工试剂研究所；浓盐酸：德阳市孝泉师范化学试剂厂；氢氧化钠：重庆北碚精细化工厂；三氯化铝、亚硝酸钠：天津市科密化学试剂开发中心；硝酸铝：天津市福晨化学试剂厂；标准芦丁（95%）：成都超人植化有限责任公司。以上试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

维嘉小型粉碎机：中山市宏威五金电器厂；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生华仪器有限公司；SHBB95型循环水式多用真空泵：郑州市长城科工贸有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛医疗器械厂；紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；电子天平：北京塞多利斯仪器系统有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蕨根粉的制备

将蕨根淘洗除去泥土等杂质，置于干燥箱中60℃干燥至恒重，粉碎，筛得20、40、60、80、120、140目蕨根粉，用塑料袋密封保存于暗箱内并及时处理。

1.2.2 总黄酮含量的测定[10]

1.2.2.1 标准液与标准曲线的制作

准确称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥（60℃、0.09 MPa）至恒重的芦丁标准品0.077 g，用60%乙醇溶解，定容至250 mL，摇匀，得浓度为0.2926 mg/mL的标准液，放置于低温暗箱内，及时检测。

分别吸取标准应用液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇添至10 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，6 min后加入4%NaOH10 mL，混匀，再用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后在波长510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，见图1。

1.2.2.2 样品液制备与样品总黄酮含量的测定

准确称取1.0 g恒干蕨根粉，用滤纸包好，放入抽提器中，用40 mL 95%的乙醇，在90℃条件下回流浸提至回流液呈无色，用乙醇洗涤接收瓶2次～3次。合并提取液与洗涤液，定容为适当浓度的样品液。

准确吸取1 mL样品液置于25 mL容量瓶中，用60%乙醇添至10 mL，其它操作同1.2.2.1，测得吸光度A。

式中：M为样品质量，g；V为定容容积，mL；C为样品液的总黄酮浓度，（mg/mL）。

1.2.3 蕨根黄酮颜色反应[11]

1.2.3.1 HCl-Mg显色反应

取样品液5 mL于试管中，加入少许镁粉，轻摇混匀，再加入1 mL浓盐酸，观察颜色变化。该实验以供试液中仅加入浓盐酸作空白对照。

1.2.3.2 与4%NaOH水溶液的反应

取样品液5 mL于试管中，加入1 mL 4%NaOH水溶液，轻摇混匀，观察颜色变化。

1.2.3.3 与AlCl3显色反应

取样品液5mL于试管中，加入1%AlCl3水溶液2mL，轻摇混匀，观察颜色变化。

2 结果与讨论

2.1 蕨根黄酮类化合物的颜色反应

将1.2.2.2获得的样品液分别与HCl-Mg、NaOH、AlCl3的起显色反应，结果如表1所示。

表 1 蕨根乙醇粗抽物的颜色反应结果Table 1 Colour reaction results of ethanol crude extracts from fern root

从表1可以看出，蕨根的乙醇提取液与HCl-Mg、NaOH、AlCl3反应分别显深红色、深黄色、亮黄色，符合黄酮类化合物与这些试剂反应的显色特性，说明蕨根提取物中有黄酮类化合物存在；综合3个颜色反应特征和不同黄酮类化合物的显色性质，可以初步判断蕨根黄酮类化合物以黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类化合物为主要组分。

2.2 提取剂种类对蕨根黄酮类化合物提取的影响

精确称取多份2.5 g粉碎度为100目的蕨根粉，分别加入水、甲醇、乙醇（95%）、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（30℃～60℃）各100 mL，在溶剂沸点温度下，回流浸提3 h，抽滤、洗涤、定容，测定黄酮类化合物含量，结果如图2所示。

由图2可以看出，实验的几种溶剂对蕨根黄酮类化合物提取能力的大小顺序是：甲醇>乙醇>丙酮>水>乙酸乙酯>石油醚。分析原因可能与蕨根中黄酮类化合物的结构及存在状态有关。因为苷和苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷等在不同的溶剂中有不同的溶解度。从蕨根黄酮类化合物在甲醇、乙醇中浸出率较高，在丙酮、乙酸乙酯、石油醚中浸出率较低的事实，结合黄酮、黄酮醇、查耳酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇等的性质，可以推测，蕨根黄酮类化合物中黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类的含量相对较高。虽然甲醇的浸出率略高于乙醇，但由于甲醇有毒，所以，本研究后续实验选择乙醇作为提取剂。

2.3 粉碎度对蕨根黄酮类化合物提取的影响

精确称取2.5 g不同粉碎度的蕨根粉，用100 mL 95%的乙醇，在溶剂沸点温度条件下，回流浸提3 h，抽滤、洗涤、定容，分别测定黄酮类化合物的含量，结果如图3所示。

由图3可以看出，粉碎度不同，蕨根黄酮提取量有很大的差异。粉碎度在20目～80目之间时，随粉碎度的增加，黄酮类化合物的浸提量增加；当粉碎度超过80目后，进一步提高粉碎度，黄酮类化合物的提取量增加不明显。分析原因，可能与黄酮类化合物存在于蕨根的特定组织有关。随粉碎度的增加，更多的组织结构被破坏，其黄酮类化合物能被溶剂更多地提取出来，但当粉碎达到一定程度后，进一步提高粉碎度，提取量不表现为继续增加。

2.4 乙醇浓度对蕨根黄酮类化合物提取的影响

精确称取多份2.5 g的80目蕨根粉，以不同浓度乙醇为提取剂，在沸点温度条件下，回流浸提3 h，抽滤、洗涤、定容，分别测定黄酮类化合物的含量，结果如图4所示。

从图4可以看出，不同乙醇浓度（体积分数）条件下，蕨根黄酮类化合物的浸提率差异较大。当乙醇浓度为40%～70%（体积分数）时，黄酮类化合物的浸出率随乙醇浓度的增加而提高；乙醇浓度70%（体积分数）时，提取率最高；超过70%（体积分数）时，随乙醇浓度增加黄酮类化合物浸提率略有降低。分析原因，可能与蕨根黄酮类化合物中既含有苷，又含有一定量的苷元有关。因为在不同浓度的乙醇溶液中水和乙醇的相对含量是不同的，苷和苷元在不同浓度的乙醇溶液中有不同的浸出特性；在乙醇浓度为70%（体积分数）左右时，苷和苷元被浸提出的总量较高。提高乙醇浓度，浸提率因苷的溶解度降低而降低。鉴于此，后续研究选择了70%乙醇溶液为提取剂。

2.5 浸提时间对蕨根黄酮类化合物提取的影响

精确称取多份2.5 g的80目蕨根粉，以70%的乙醇溶液为提取剂，在沸点温度下，分别回流浸提不同时间，抽滤、洗涤、定容，测定黄酮类化合物的含量，结果如图5所示。可以看出，浸提时间在120 min以内，随提取时间的增加，黄酮类化合物的浸出量也随之增加。当浸提时间超过120 min后，蕨根黄酮类化合物的浸出量增加不明显。浸提超过150 min后，黄酮类化合物量略有降低。分析原因可能与黄酮类化合物中的某些组分在试验温度下分解损失，或与浸提时间延长，淀粉糊化量增加而阻碍了部分黄酮类化合物被浸提出来有关。

2.6 浸提温度对蕨根黄酮类化合物提取的影响

精确称取多份2.5 g的80目蕨根粉，加入70%（体积分数）乙醇为提取溶剂，分别在25（室温）、40、50、60、70、80、90℃条件下回流浸提120 min，抽滤、洗涤、定容，分别测定黄酮类化合物的含量，结果如图6所示。

从图6可以看出，温度低于70℃，随温度的升高，黄酮类化合物的浸出率提高；25℃（室温）时蕨根黄酮类化合物浸出率最低，70℃时黄酮类化合物的浸出率最高。当温度超过70℃后，其浸出率随温度升高而略有下降。分析原因，可能与在一定温度范围内升高温度有利于提高黄酮类化合物溶解度有关；但当温度超过70℃后，可能因淀粉部分糊化阻碍黄酮类化合物浸出，或因部分热不稳定成分受热被破坏有关。

2.7 液料比对蕨根黄酮类化合物提取的影响

精确称取多份2.5 g 80目蕨根粉，分别按液料比（mL∶g） 为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入70%（体积分数）乙醇，在70℃条件下回流浸提120 min，抽滤、洗涤、定容，测定黄酮类化合物的含量，结果如图7所示。可以看出，随液料比从10∶1（mL∶g）增加为25∶1（mL∶g），黄酮类化合物的浸出率明显增加；超过25∶1（mL∶g）后浸出率增加缓慢。分析原因可能与蕨根中黄酮类化合物含量较高，而在溶剂内的溶解度又有限有关。当溶剂用量在一定范围内增加时，黄酮类化合物的浸出量增大，浸出率增加。但当溶剂用量增加到一定程度后，蕨根中黄酮类化合物几乎已全部溶出，此时增加溶剂用量不能进一步提高浸出率。因此，选择适当的液料比对提高蕨根黄酮的浸出率和减少溶剂用量有着重要的意义。

2.8 正交试验

在乙醇浓度、液料比、浸提温度、浸提时间的实验结果中，选择单因子试验结果较好的参数，设计了正交试验，结果如表2所示。

表 2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results

从正交试验结果可以看出，极差RA>RB>RD>RC，液料比对蕨根黄酮类化合物浸出率的影响最大，其次是乙醇的浓度、提取的温度值，提取时间对黄酮浸出率的影响最小。乙醇回流浸提蕨根黄酮类化合物的最佳浸提条件为A2B2C1D2。即液料比为25∶1（mL/g），提取温度为70℃，提取时间为120 min，乙醇浓度为70%。在此条件下，3次重复实验，蕨根中黄酮类化合物的含量为54.12 mg/g。

3 结论

1）综合蕨根黄酮类化合物的显色反应、溶剂种类与浓度对其黄酮类化合物的影响，可以初步推测蕨根黄酮类化合物主要以黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类化合物等为组分。

2）将蕨根粉碎到过80目筛是黄酮类化合物提取时适宜的粉碎度；甲醇和乙醇是较好的蕨根黄酮类化合物提取剂。

3）在乙醇浓度、浸提时间、浸提温度、液料比4个因素中，液料比对蕨根黄酮类化合物浸出率的影响最大，乙醇浓度、提取温度次之，提取时间对黄酮类化合物的浸出率影响最小。在温度为70℃条件下，以70%（体积分数）乙醇溶液为提取剂，液料比25∶1（mL/g），回流浸提120 min，蕨根黄酮类化合物提取量达到54.12mg/g。

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Study on Extraction of Flavonoids from Fern（Pteridium aquilinum L.） Root

ZHANG Chao，YIN Li－guo，XU Zhou，WEI Qin
（College of Life Science and Food Engineering，Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，Yibin University，Yibin 644000，Sichuan，China）

The extraction of flavonoids from fern （Pteridium aquilinum L.）root was carried out.The singlefactor experiments indicated that grinding degree，extractant kinds and concentration，extracting time，extracting temperature and liquid－solid ratio had much effect on the extraction of flavonoids.The orthogonal experiments showed that the respective effects of liquid －solid ratio，ethanol concentration，extracting temperature and extracting time on the leaching rate of flavonoids decreased progressively among the four factors.The extraction amount of flavonoids from fern （Pteridium aquilinum L.）root came to 54.12 mg/g under the following conditions 70%ethanol（volume fraction） as extractant，the ratio of liquid －solid 25 ∶1，temperature 70℃，and extracting time 120 min.

fern（Pteridium aquilinum L.）root；refluxing extraction；flavonoids

宜宾市科技局重点项目（200801007）

张超（1966—），男（汉），副教授，硕士研究生，主要从事生物工程与食品生物技术研究。

2011-08-01