吸烟对精液DNA指标影响的研究*

武俊青 李玉艳 高尔生 戎 芬 Melbourne Frank Hovel Ming Ji Ding Ding

吸烟对男性生殖能力的影响，特别是对精液质量的影响，近年来已引起社会的广泛关注。大量研究证明烟草中一些物质可以诱导染色体发生畸变〔1〕。吸烟不仅可能影响精液常规指标，还可能导致精液DNA指标以及其他指标的改变，但目前检测精液中DNA含量的情况仅限于小样本的不育人群，吸烟对精液DNA含量的影响未见报道。为此，我们选择吸烟与不吸烟者共322例，对其进行问卷调查并收集精液标本，分析吸烟对精液DNA指标的影响及其影响程度。

对象与方法

1.研究对象

本研究方案经伦理委员会批准后，在江苏省常熟地区进行，选择既往身体健康、年龄在20～59岁的男性，排除生殖道感染及各种手术史，无高温及有害物质接触史，且内外生殖器官发育均正常，经知情同意后纳入为研究对象。共收集合格的研究对象322例，近3年有吸烟习惯，每天至少吸1支，连续吸半年及以上者为吸烟组共195例，不吸烟组127例。取其完整精液为标本进行分析。

2.方法

(1)问卷调查:由统一培训的调查员调查研究对象的一般人口学特征、生活习惯及环境、有害物质接触及疾病用药史等，还重点调查了研究对象是否吸烟、开始吸烟年龄、吸烟年限、每日吸烟量等。

(2)精液采集及分析:要求对象取精前禁欲3～6天，在专门的取精室用手淫法留取全部精液于无菌取精杯中。室温保持在(25±3)℃左右。细胞成熟程度与DNA含量密切相关。初级精母细胞经两次减数分裂所形成的精子细胞，其每条染色体仅为1条染色单体，DNA含量相当于初级精母细胞DNA含量的1/4。采用流式细胞术统一检测精液DNA指标。经加工处理可以计算出:碎片及凋亡细胞、单倍体精子、单倍体与二倍体之间的各级分化细胞、二倍体细胞及多倍体细胞的比例共5个指标。正常精液中单倍体精子所占比例较高(＞90%)，而精液异常时单倍体精子所占比例降低，碎片细胞、二倍体及多倍体细胞的比例可能增加。由于五个指标均为非正态分布，其和为100%，其中最为重要的是单倍体精子，因此，研究未对所有5个指标均进行分析，只对单倍体精子比例、二倍体细胞比例和多倍体细胞比例进行了分析。

(3)质量控制:本研究采用统一的问卷调查及精液采集和检测方法。研究开始前集中对相关研究人员进行严格的培训，统一问卷的填写标准;研究过程中严格执行对象的筛选条件和精液采集条件。固定专门的实验室技师进行统一检测。

(4)统计学分析:用Epi-info软件建立数据库，双人双遍数据录入并进行校对，数据库固定后采用SAS 9.2软件包进行非参数检验、logistic回归等统计分析。

结 果

1.一般情况

吸烟和不吸烟对象的年龄、文化程度、职业、人均年收入、坐姿工作、是否使用计算机、接触有害物质、婚姻状况、遗精史、是否避孕、配偶是否妊娠过等特征的分布差异无统计学意义。研究对象的生活习惯有差异，吸烟对象饮茶、饮酒、穿紧身裤的比例均高于不吸烟的对象。吸烟者家用电器个数4个以下的比例略低于不吸烟者。吸烟对象的吸烟暴露情况见表1。

2.是否吸烟对精液DNA指标的影响

按单倍体精子、二倍体细胞及多倍体细胞比例的四分位数(P25、P50、P75)为界值，分别将其分为四组(＜ P25组、P25～组、P50～组、P75～组)，采用降序拟合三个有序多分类logistic回归模型，分析吸烟对各指标分布是否有影响及其影响程度。结果显示:吸烟可能使单倍体精子比例降低(OR=0.55，95%CI:0.37～0.83);吸烟组二倍体细胞(OR=1.99，95%CI:1.32～2.98)、多倍体细胞(OR=2.43，95%CI:1.61 ～3.66)的比例升高。调整年龄、接触有害物质、是否饮茶及饮酒、使用电器个数的多因素非条件logistic回归分析结果与单因素分析的结果一致，仍然提示吸烟可能使单倍体精子比例降低(OR=0.63，95%CI:0.41～0.97)，同时可能增加二倍体细胞(OR=1.67，95%CI:1.08～2.57)和多倍体细胞(OR=1.85，95%CI:1.20～2.86)的比例，见表2。

表1 吸烟对象的暴露情况

3.吸烟相关因素对精液DNA指标的影响

为进一步了解吸烟对精液DNA的影响及其影响程度，对吸烟量进行分组，拟合logistic回归模型分析不同吸烟剂量对精液DNA各指标分布的影响。结果显示:与不吸烟组相比，吸烟年限20年及以上、每日吸烟量15支及以上和总吸烟量≥10万支的对象单倍体精子趋向于更低的等级分布;而吸烟20年以下、每日吸烟支数15支以下、总吸烟量10万支以下的对象单倍体精子的分布和不吸烟组相比无统计学差异;对于二倍体细胞和多倍体细胞，其各剂量组与不吸烟组相比，均趋向于较高的等级分布(除每日吸烟量＜15支组的二倍体细胞外)，结果见表3。调整年龄、接触有害物质、是否饮茶及饮酒、电器个数的多因素非条件logistic回归分析结果显示:单倍体精子分析结果与单因素分析的结果一致，而对于二倍体细胞和多倍体细胞，只有高剂量组趋向于更高的等级分布，而低剂量组与不吸烟组相比无统计学差异。结果提示吸烟年限、每日吸烟量及总吸烟量，达到一定程度时，就可能影响精液中单倍体精子、二倍体细胞及多倍体细胞的比例。

表2 吸烟对精液DNA指标影响的logistic回归分析

表3 吸烟相关因素对精液DNA指标影响的logistic回归分析

讨 论

影响精液质量的因素众多，如重金属〔2〕、性生活方式〔3〕、吸烟〔4〕等。近年来，国内外已经开展了一些有关吸烟与精液质量的研究。精液质量常用精液量、精子密度、精子活率、精子活力及精子形态等指标来衡量〔5〕。然而吸烟不仅可能影响精液常规指标，使精子的数量减少和活动率降低，畸形精子的发生率增多，还可能直接损害精子，导致精子DNA指标以及其他指标的改变;吸烟可能影响生殖细胞的成熟和增殖，是精子发生的致突变物质〔6〕。

烟草浓聚物及其代谢产物中富含诱基因突变和诱癌物质，这些物质使调节精子生成的遗传基因合成受阻。精子的产生包括精细胞数量的增多和繁殖细胞的分化成熟，全部过程均需要核糖核酸和蛋白质合成的参与，因此该合成过程受阻，可引起精子DNA突变及畸形精子增加。动物模型的研究结果表明:吸烟可导致精子微核畸变率增加。

国外以男性为研究对象，也开展了大量相关实验室研究。结果提示:吸烟可以增加精液DNA的氧化损害，还可能影响DNA的完整性导致其断裂，同时可能增加DNA的脆弱性。Horak等〔7〕募集了179名男性，其中健康志愿者86人和有生育力损害的病人93名，分析了他们精子中大的DNA片段的水平。其结果显示:在健康志愿者中，现吸烟者精子中大DNA片段的水平是非吸烟者的2.7倍(P=0.008)。Arabi M〔8〕等对尼古丁与精子质膜、DNA完整性以及精子活力的研究结果表明:尼古丁能够诱使精子中双链DNA断裂，对于精子质膜和DNA完整性而言，尼古丁是一种潜在的氧化因子。

国内学者对吸烟与人类精子染色体的关系开展了研究，结果均显示:与不吸烟者相比，吸烟可导致人精子单倍染色体畸变率增高。其中，张昌军等〔9〕对37名平均年龄32岁(28～34岁)具有生育能力、无酗酒史的健康男性进行研究，结果发现:不吸烟者的染色体结构畸变精子率为4.05%，轻度吸烟者(20支/日)的染色体结构畸变精子率为8.31%，而重度吸烟者(40支/日)染色体结构畸变精子率高达13.83%(P＜0.01)。

然而，也有一些研究发现吸烟不影响精子DNA指标。Sergerie等〔10〕将97名健康志愿者分为不吸烟组、轻度吸烟组和重度吸烟组，比较三组的精子DNA碎片水平和镉含量的差别。结果显示:精子DNA碎片的比例在三组之间没有统计学差异。上述结果可能和研究样本含量较小，或分析时没有考虑可能的混杂因素有关。

本研究结果表明，当吸烟量达到一定程度时，就可能影响精液中DNA指标。吸烟可使精液中单倍体精子的比例降低，同时使二倍体细胞以及多倍体细胞的比例升高。因此吸烟对精液质量是有害的，尽管在一些研究中，没有发现吸烟对精液常规指标有明显的影响，但可能已经导致了精液DNA指标以及其他指标的改变。香烟对精液质量的损害受多种因素的影响，而不同的精液指标对烟草的敏感程度也是不同的。不同对象对香烟的耐受程度也可能有所不同，但当吸烟达到一定的剂量时即会对精液质量产生影响。

1．Jin YL，Wang HZ，Gu H．Observation of chromosome aberration and micronucleus formation in peripheral blood lymphocytes among cigarette smokers．Chung Hua Liu Hsing Ping Hsueh Tsa Chih(CHINA)，1997，18(1):40-42．

2．Wu JQ，Liang CL，Gao ES，et al．The Canonical correlation analysis on semen quality and serum heavy metals in Chinese young men．Reproduction and Contraception，2003:14(2):119-128．

3．Wu JQ，Gao ES，Tao JG，et al．Principal component analysis on semen quality among Chinese young men．Journal of Reproduction and Contraception，2007，14(1):56-63．

4．Kunzle R，Mueller MD，Hanggi W，et al．Semen quality of male smokers and nonsmokers in infertile couples．Fertil Steril，2003，79(2):287-291．

5．Wu JQ，Yang QY，Tao JG，et al．Reference value of semen quality in Chinese young men．Contraception，2002(65):365-368．

6．杨焱，姜垣，杨小丽等．我国六城市社区居民戒烟服务需求现状．中国健康教育，2004，20(9):773-776．

7．Horak S，Polanska J，Widlak P．Bulky DNA adducts in human sperm:relationship with fertility，semen quality，smoking，and environmental factors．Mutat Res，2003，537(1):53-65．

8．Arabi M．Nicotinic infertility:assessing DNA and plasma membrane integrity of human spermatozoa．Andrologia，2004 Oct，36(5):305-310．

9．张昌军，刘浩，王华等．吸烟对人精子单倍染色体的影响．中国优生与遗传杂志，2003，11(6):47-48．

10．Sergerie M，Ouhilal S，Bissonnette F，et al．Lack of association between smoking and DNA fragmentation in the spermatozoa of normal men．Hum Reprod，2000，15(6):1314-1321．