黑花生色素抗氧化性研究

李楠

（天津渤海职业技术学院，天津 300402）

黑花生衣色素中花色苷类色素含量丰富。研究发现，花色苷类色素具有抗氧化、清除自由基等作用。自由基学说认为，自由基是引起机体衰老的根本原因，消除体内多余自由基具有延长寿命的功效。本文以黑花生衣色素(BPSP)为原料,研究了该色素对自由基的清除作用,为该色素在食品中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

黑花生：市售；DPPH：日本东京化成工业株式会社；T ris-HCl缓冲液,邻苯三酚,柠檬酸、FeSO4-EDTA、蔗糖酯、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、α-脱氧核糖、磷酸二氢钠、盐酸、VC等试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Vv-7504紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；FA－2004A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；精密数显酸度计：上海天达仪器有限公司；UV-1249紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HP20大孔树脂：天津南开大学化工厂。

1.3 方法

1.3.1 黑花生衣色素提取方法

将黑花生衣置于烧杯中，加入pH=1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液进行浸提，其中料液比（g/mL）为1∶50，放入80℃恒温水浴中浸提2 h，浸提级数为2级[1]；取滤液,再经HP20树脂吸附、80%乙醇洗脱旋转蒸发得到BPSP浓缩膏待用[2]。

1.3.2 黑花生衣色素抗氧化能力的测定

1.3.2.1 清除羟自由基能力的测定[3]

分别取 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL 6 个不同浓度的待测液各0.2 mL，依次加入10 mmol/L FeSO4-EDTA混合液0.2 mL、10 mmol/L的α-脱氧核糖溶液0.2 mL，而后用磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4，0.1 mol/L）定容至1.8 mL，再加入10 mmol/L H2O20.2 mL和1 mL的浓度为5%蔗糖酯，混匀后置于25℃恒温水浴中反应1 h后，加入1 mL三氯乙酸（TCA，2.8%）溶液，和 1 mL硫代巴比妥酸溶液(TBA，1.0%)，混匀后置于沸水浴中反应15 min，冷却后以PBS为参比于520 nm处比色测定吸光值为A。同时做空白试验,所测吸光值为A0。以VC为阳性对照进行试验。按下式计算清除能力，并绘制清除率与样品浓度曲线。

1.3.2.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定[4]

取 2.7 mL Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L、pH 8.2），加入蒸馏水0.1 mL，于25℃恒温水浴10 min后，加入0.2 mL邻苯三酚溶液（30 mmol/L、25℃），迅速混匀，在520 nm处测定溶液的吸光度A1。分别取浓度为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的待测液各 0.1 mL，加入2.7 mL Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L、pH 8.2），于 25 ℃恒温水浴10 min，加入25℃预热的10 mmol/L HCl溶液0.2 mL，迅速混匀，在520 nm处测定溶液的吸光度A2。取浓度分别为 0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的待测液各0.1mL，加入2.7mLTris-HCl缓冲液（0.05mol/L、pH 8.2），于25℃恒温水浴10 min后,加入0.2 mL邻苯三酚溶液（30 mmol/L、25℃），迅速混匀，在520 nm处测定溶液的吸光度A3。以VC为阳性对照进行试验。按下式计算清除能力，并绘制清除率与样品浓度曲线。

1.3.2.3 清除自由基效能力的测定——DPPH法[5]

将提取液配制成 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL 7个浓度，分别吸取样液2.0 mL，加入浓度为2.0 mg/mL DPPH·乙醇溶液2.0 mL，摇匀、于25℃水浴30 min，以95%乙醇为对照，在520 nm处测定试液的吸光度A1。同时，为扣除试剂本身颜色的影响，取2.0 mL待测样液与2.0 mL 95%乙醇进行混合，以95%乙醇为对照，在520 nm处测定试液的吸光度A2。2.0 mL将DPPH·乙醇溶液与2.0 mL 95%乙醇混合，同样以95%乙醇为对照，在520 nm处测定试液的吸光度A3。每组测定3次，求取平均值，按下述公式计算样品的抑制率。以VC为阳性对照进行试验。按下式计算清除能力，并绘制清除率与样品浓度曲线。

2 结果与讨论

2.1 黑花生衣色素清除羟自由基的效果

黑花生衣色素和VC对羟自由基的清除效果见图1。

图1 黑花生衣色素和VC对羟自由基清除率对比Fig.1 Comparison BPSP and VCon the elimination of·OH

由图1可以看出，同等浓度下VC对于羟自由基的清除效果优于黑花生衣。黑花生衣色素和VC对于羟自由基的清除效果均随着浓度的增大而增强。当黑花生衣色素和VC浓度超过0.1mg/mL时，清除率增加速度明显减缓，浓度增加对清除效果影响不大。

2.2 黑花生衣色素清除超氧阴离子自由基的效果

黑花生衣色素和VC对超氧阴离子自由基的清除效果见图2。

图2 黑花生衣色素和VC对超氧阴离子自由基清除率对比Fig.2 Comparison BPSP and VCon the elimination of·O2-

由图2可以看出，同等浓度下VC对超氧阴离子自由基的清除效果优于黑花生衣。黑花生衣色素和VC对于超氧阴离子自由基的清除效果均随着浓度的增大而增强。当黑花生衣色素和VC浓度超过0.1 mg/mL时，浓度增加对自由基清除效果影响不大。

2.3 黑花生衣色素清除DPPH自由基的效果

黑花生衣色素和VC对DPPH自由基的清除效果见图3。

图3 黑花生衣色素和VC对超氧阴离子自由基清除率对比Fig3 Comparison BPSP and VCon the elimination of DPPH·

由图3可见，同等浓度下VC对DPPH自由基的清除效果优于黑花生衣。黑花生衣色素和VC对于DPPH自由基的清除效果均随着浓度的增大而增强。当黑花生衣色素和VC浓度超过0.6 mg/ml时，清除率基本不再上升，说明浓度超过0.6 mg/ml后浓度增加对自由基清除效果影响不大。

3 结论

不同抗氧化体系所测的结果往往存在一定的差异，因此,本次实验采用三种抗氧化体系对黑花生衣色素的抗氧化活性进行评价。实验表明,黑花生衣色素对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（·O2－）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）均具有良好的清除效果。说明黑花生衣色素是一种具有抗氧化活性的天然植物色素，不仅可用于食品的着色，而且可以起到抗衰老、防癌、抗癌等良好的保健作用。

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