响应面法优化Bacillus subtilis NP29产纤维素酶发酵条件的研究
2012-12-03杨丽娜龚月生
杨丽娜 张 建 龚月生
（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）
纤维素（cellulose）是世界上最为丰富的可再生资源和碳水化合物。我国以农作物秸秆为代表的纤维素类资源十分丰富，每年产量可达6亿多吨。除反刍动物瘤胃微生物可降解转化一部分纤维素外，大部分纤维素难以被动物消化利用。同时，由于耕地面积锐减和人口急剧增加，使得人畜争粮的问题愈加突出。通过微生物产生的纤维素酶降解、利用纤维素资源已经成为当今饲料工业非常规资源开发研究的重点[1-2]。
来源于微生物的发酵产品已经广泛应用于工业生产和人们生活中，但过高的发酵成本依然制约着发酵工业的发展[3]。因此，如何降低发酵成本成为现代发酵工业的研究热点。发酵条件的优化是提高微生物产酶量、降低发酵生产成本的重要途径。目前，在发酵条件优化过程中，常使用的试验设计包括单因素、正交试验、响应面法等[4-6]。但考虑到影响发酵条件之间的交互作用以及优化后的效果常使用响应面法和正交设计。
本课题组从杨凌地区腐烂秸秆和腐殖质土壤样品中分离出一株耐热、耐酸碱性强且产酶量较高的纤维素降解菌NP29,经鉴定其属于枯草芽孢杆菌。该酶反应的最适pH值为4.5，最适反应温度为65℃,具有良好的pH值稳定性和热稳定性[7]。本试验以菌株NP29为研究对象，采用响应面法对主要的液体发酵因素进行优化，以期快速有效地确定该菌株产酶的最佳条件，提高其产酶能力。
1 材料与方法
1.1 材料
菌种为Bacillus subtilis NP29菌株，由本实验室分离并保藏。
基础培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物 5.0 g、NaCl 10.0 g、H2O 1 000 ml，pH 值自然。
初始产酶培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10 g、可溶性淀粉20 g、稻壳粉5 g、蛋白胨10 g、酵母提取物 10 g、K2HPO41 g、NaH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.15 g、MnSO40.000 5 g、H2O 1 000 ml，pH值7.0。
1.2 方法
1.2.1 纤维素酶粗酶液的制备
取摇瓶发酵液，4℃、10 000 r/min离心10 min，上清液即为纤维素酶粗酶液。
1.2.2 羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定方法
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定CMCase[8]。取经适当稀释的粗酶液0.1 ml，加入已预热至65℃的0.5%（w/v，pH值4.5）的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液0.9 ml，在65℃反应5 min后立即加入2 ml DNS，煮沸 5 min，流水冷却稀释至 20 ml，540 nm 波长处测吸光值，加热失活的酶液作为空白对照。将在上述条件下每分钟由底物生成1 μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位，用U/ml表示。
1.2.3 Plackett-Burman试验
使用Plackett-Burman试验筛选枯草芽孢杆菌NP29产纤维素酶培养基的重要影响因素。应用Design Expert 8.0软件对影响菌株NP29产纤维素酶的9个因素进行筛选，每个因素分别确定高（+）和低（-）两个水平。选择N=12的设计进行试验，通过Design Expert 8.0软件对试验数据进行分析，获得多元一次回归方程：
式中：Y——CMCase的预测值（U/ml）；
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9分别为发酵过程中的参数；
1.2.4 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman试验中找到对CMCase活性影响最大的主要因素后，通过使主要因素同时朝响应值增大的方向变化，找到响应值的最大值，从而逼近最大响应区域。
1.2.5 Box-Behnken试验
根据最陡爬坡试验结果，以CMCase酶活性为响应值，以主要发酵因素为自变量，利用Design Expert 8.0软件进行Box-Behnken试验设计，试验数据进行回归拟和并对拟和方程作显著性检验及方差分析，制作响应面和等值线。
1.2.6 验证试验
根据前面试验所得到的最佳发酵产酶条件进行试验，将所测定的CMCase活性与响应面预测结果进行比较，以验证模型的可靠性。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman试验
利用Plackett-Burman试验从影响枯草芽孢杆菌NP29菌株产纤维素酶的9个发酵因素中筛选出显著影响CMCase活性的主要因素。各因素及水平见表1，试验设计与结果见表2,各因素主效应分析结果见表3。
表1 Plackett-Burman试验设计各因素水平
表2 Plackett-Burman试验设计及结果
表3 Plackett-Burman试验各因素主效应分析结果
通过Design Expert 8.0软件对试验数据进行分析，得到多元一次回归方程：
该回归模型P=0.035 1＜0.05，说明该模型显著。各发酵因素对Bacillus subtilis NP29产耐热性纤维素酶的影响显著性顺序为：温度＞可溶性淀粉＞接种比例＞胰蛋白胨＞起始pH值＞稻壳粉＞酵母提取物＞装瓶量＞羧甲基纤维素钠。其中，温度与可溶性淀粉显著影响CMCase活性（P＜0.05），接种比例对响应值的影响虽不显著（P=0.051 2），但仍具有较大影响，也予以考虑。因此，要提高该菌株产酶量，应该提高淀粉含量和培养温度，降低接种比例。
2.2 最陡爬坡试验
响应面拟合出的方程只有在临近最佳值的区域内才能充分接近真实情形,因此,必须逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程[9]。根据Plackett-Burman试验中各发酵因素对CMCase大小的正、负效应确定其余因素的水平分别为:羧甲基纤维素钠20 g/l、稻壳粉 5 g/l、胰蛋白胨 15 g/l、酵母提取物 15 g/l、pH值8.0、装瓶量80 ml/250 ml。对淀粉含量、培养温度和接种比例进行最陡爬坡试验,试验设计与结果见表4。从结果可以看出，试验4可达最大CMCase活性，因此以该试验的条件作为Box-Behnken试验的中心点。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
2.3 Box-Behnken试验
采用Box-Behnken试验进行3因素3水平的中心组合试验，试验包括12个析因试验和3个中心试验，试验设计及结果见表5。
表5 Box-Behnken试验设计及结果
利用Design Expert 8.0软件对表5结果进行处理，确定回归方程为：
该回归方程的方差分析见表6，其中模型P=0.008 8＜0.05，失拟项 P=0.120 0＞0.05，说明该模型回归显著而失拟不显著。另外，该方程回归系数R2=0.950 8，说明该方程的拟合程度较好，预测值和实际值之间具有高度的相关性，可以应用于枯草芽孢杆菌NP29菌株产纤维素酶的理论预测。同时得出当淀粉含量、培养温度、接种比例分别为21.44 g/l、41.07℃、1.88%时，理论最大CMCase活性为4.263 U/ml。
表6 二次多项模型方差分析
利用Design Expert 8.0软件绘制的响应面图及等值线图见图1。由响应面图可以看出淀粉含量、培养温度、接种比例之间存在交互作用，在试验水平内，随淀粉含量、培养温度、接种比例的升高，CMCase活性呈先升高后降低的趋势。
2.4 验证试验
根据试验得出菌株NP29产纤维素酶的最佳发酵条件是：羧甲基纤维素钠20 g/l、稻壳粉5 g/l、胰蛋白胨15 g/l、酵母提取物15 g/l、pH值8.0、装瓶量80 ml/250 ml、淀粉21.44 g/l、接种比例1.88%、培养温度41.07℃。在此条件下培养36 h后测定CMCase活性，3个平行试验的结果分别为 4.258、4.302、4.273 U/ml，平均值为4.278 U/ml，与理论预测值仅相差0.35%，可见该模型能够很好地预测菌株NP29的产酶条件。
图1 响应面法三维曲面图和等高线
将种子培养基按1.0%接种于初始产酶培养基中37℃培养36 h后测定CMCase活性为2.021 U/ml，因此，利用响应面法获得的最佳产酶条件可使CMCase活性提高111.68%。
3 结论与讨论
纤维素酶在饲料、食品、纺织、酿造、化工等诸多领域被广泛应用，对解决能源危机、食物短缺、环境污染等具有重大的现实意义[10-11]。随着纤维素酶用量的不断增加，纤维素酶生产呈现良好的上升势头。但目前发酵工业中发酵成本过高严重制约着纤维素酶的进一步应用。为了提高纤维素酶的产量，越来越多的国内外学者开始将研究重点转向纤维素酶的发酵生产，使得发酵技术不断提高，发酵工艺不断改善。
响应面法是用来对受多个变量影响的响应值进行优化的一种回归分析方法,具有试验次数少、周期短，求得的回归方程精确度高,又能研究几个因素间交互作用[12]等优点。目前,利用该方法对不同微生物的发酵条件进行优化,均不同程度地提高目标产物的产量。张欢等[13]采用响应面法优化HA-A38菌株的发酵培养基,结果显示菌体浓度增加了近1倍。唐志红等[14]利用该方法优化YDX-1菌株的发酵条件,纤维素酶活性提高了81.97%。顾芮萌等[15]使用响应面法优化粗糙脉孢菌的液体培养基,使FPA活性提高了2.03倍,CMCase活性提高了1.88倍,木聚糖酶活性提高了1.86倍,葡萄糖苷酶活性提高了2.08倍。这表明，响应面法是一种科学、合理的优化响应值的方法。
本研究利用响应面法优化枯草芽孢杆菌NP29菌株产纤维素酶培养条件,用以提高该菌株的产酶量。研究结果表明,淀粉含量、培养温度和接种比例是影响该菌株纤维素酶产量的最重要的三个因素。而通过最陡爬坡法和响应面优化试验得到了最佳的发酵条件,即羧甲基纤维素钠 20 g/l、稻壳粉5 g/l、胰蛋白胨15 g/l、酵母提取物 15 g/l、pH 值 8.0、装瓶量 80 ml/250 ml、淀粉含量21.44 g/l、接种比例1.88%、培养温度41.07℃。在此条件下获得的纤维素酶活性较优化前提高了111.68%。
