几种脱毒剂对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮体外吸附脱毒效果的比较研究

叶盛群 谌 刚

(浙江三鼎科技有限公司，浙江绍兴 312000)

霉菌毒素（Mycotoxins）普遍存在于饲料及其原料中，会对饲料业、畜牧业和人类健康造成严重危害[1]。据报道，全世界约有25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染。霉菌毒素既可在谷物田间生长时产生（如镰刀菌毒素），也可在储存期间产生（如黄曲霉毒素）。饲料中常见并对动物产生严重危害的霉菌毒素主要有：黄曲霉毒素 (Aflatoxin,AF)、玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）、呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)、烟曲霉毒素（Fumonisins，FUM）等[2-3]。目前处理霉变饲料最成熟有效的方式是吸附法，即通过在饲料中添加非营养性吸附剂，吸附饲料中的霉菌毒素，并与之紧密结合，使霉菌毒素在通过动物消化道时不被动物所吸收，而直接排出体外，从而避免了霉菌毒素对动物的危害。常见的霉菌毒素吸附剂主要有：无机吸附剂（如天然硅铝酸盐类矿物材料）和有机吸附剂（如葡甘露聚糖类），但这些吸附剂均存在一定的不足。

为了比较不同脱毒剂间的具体脱毒效果，为更好地解决饲料中霉菌毒素的污染提供理论依据。本文选取市场上常见9种脱毒剂以及浙江三鼎科技有限公司自行研发的一种脱毒剂，采用ELISA法，分别检测其对AFB1和ZEN的体外脱毒能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

FA1004分析天平；SK-1快速混匀器；LXJ-IIB型高速离心机；SHZ-82型恒温水浴振荡器；RT-6000酶标仪。

1.1.2 试剂

AFB1、ZEN 标准品(德国 R-Biopharm 公司)；AFB1、ZEN酶联免疫定量测试盒(德国R-Biopharm公司)；甲醇（色谱级）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾（均为分析纯）。

1.1.3 脱毒剂

市场上常见的9种脱毒剂，其编号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#；

浙江三鼎科技有限公司生产的改性蒙脱石，其编号为10#。

1.2 试验方法

1.2.1 吸附试验

参照Phillips[4]的方法，在浓度为75 μg/kg的AFB1（1～2 mg/kg ZEN）的标准溶液中分别加入一定量的上述吸附剂，使各种吸附剂的浓度为2.5 mg/ml，pH值7.0的条件下，37℃、120 r/min的恒温振荡水浴锅上振荡处理60 min。反应结束后于5 000 r/min下离心10 min，并收集上清液，ELISA法测定上清液中剩余AFB1和ZEN的含量。按下列公式计算吸附量Q(μg/g)和吸附率Y(%)：

式中：V为溶液的体积 (ml)；m为吸附剂的用量(mg)；C0、C分别为反应前后霉菌毒素的浓度(ng/ml)。

1.2.2 解吸附试验

上述试验结束后，倾去离心管中上清液，在剩余物中加入10 ml甲醇提取液，在37℃、120 r/min的恒温振荡水浴锅上振荡处理10 min，反应结束后于5 000 r/min下离心10 min，并收集上清液，ELISA法测定上清液中AFB1和ZEN的含量,经残液校正后，计算解吸率。解吸过程重复3次,求累积解吸率R(%)。

其中：m为3次解吸上清液中毒素的含量（ng）；m0为解吸附前复合物中毒素的含量（ng）。

1.3 数据处理

根据各样品OD值,用EXCEL 2003计算各样品中AFB1和ZEN的含量；所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，结果采用平均数±标准差(X±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 不同脱毒剂对AFB1吸附率和解吸附率的影响（见表1）

表1 不同脱毒剂对AFB1的影响

从表1吸附率看，上述10种脱毒剂对AFB1均有一定程度的吸附作用，吸附AFB1能力的大小顺序为：3#＞10#＞1#＞9#＞5#＞2#＞8#＞4#＞7#＞6#，且除 4#、6#、7#三种脱毒剂外，其余七种脱毒剂对AFB1的吸附脱毒率均在90%以上；从解吸率看，3#和8#虽然对AFB1具有较高的吸附脱毒率，但同时解吸率也高，说明其吸附AFB1后所形成的复合物稳定性较差。

2.2 不同脱毒剂对ZEN吸附率和解吸附率的影响（见表2）

表2 不同脱毒剂对ZEN的影响

由表2可知，上述10种脱毒剂对ZEN均有不同程度的吸附脱毒作用，并且脱毒剂间吸附脱毒率差异显著，吸附脱毒率在16%～92%变化。综合吸附率与解吸率的结果，10种脱毒剂中对ZEN吸附脱毒率效果较好的是：10#＞6#＞2#＞1#。

3 讨论

影响霉菌毒素脱毒剂脱毒效果的因素很多，如脱毒剂的组成成分，霉菌毒素的分子结构及其理化性质[5]、饲料原料的霉变程度、脱毒剂的添加量、试验方法以及霉菌毒素的检测方法等。

3.1 霉菌毒素理化性质的影响

霉菌毒素是一大类物质，不同种类的霉菌毒素由于其分子大小、分子结构、电荷分布以及分子极性等理化性质均不同，从而导致同一种脱毒剂对不同的霉菌毒素吸附脱毒率不同。AFB1分子式C17H12O6，分子量312，其结构中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，并且AFB1是一种强极性分子，因此一类具有较大比表面积，表面带有大量亲水性无机阳离子的物质，对AFB1有一定的吸附脱毒作用，这与本试验结果相符。ZEN分子式C18H22O50，分子量318，其结构中含有两个酚羟基的内酯，由于其结构中含有内酯，故易在碱性溶液中将酯键打开，从而溶于水；当碱的浓度降低时又可将键恢复,并且ZEN是一种具有双极性或弱极性的分子[6]，导致同一种吸附剂对AFB1和ZEN的吸附脱毒率不同。

3.2 脱毒剂组成成分的影响

脱毒剂的晶体结构和物理特性（包括它的总电荷量、电荷的分布、空隙的大小以及比表面积），是影响霉菌毒素吸附脱毒效果的又一主要因素之一。目前市场上的脱毒剂主要以霉菌毒素吸附剂为主，不同厂家生产的脱毒剂其组成成分不同，如美国奥特奇公司生产的“霉可吸”主要由酿酒酵母细胞壁内部的提取成分组成，试验研究结果表明，其对ZEN具有较好的吸附脱毒率，也对AFB1具有一定的吸附脱毒能力；这是由于酵母细胞壁上含有大量的多糖、蛋白质和脂类，这些物质可以通过氢键、离子键和疏水作用实现对ZEN的吸附脱毒；同时由于酵母细胞壁上的寡糖具有较大的比表面积，表面富含不同孔径的多孔结构，因此对AFB1也有一定的吸附脱毒作用。浙江三鼎科技有限公司生产的脱毒剂主要由钙基蒙脱石所组成。天然钙基蒙脱石属于2.1型层状硅酸盐矿物，由两层硅氧四面体夹一层铝氧八面体组成，具有大量的天然纳米微孔，结构中存在同质取代现象，层间带有大量可交换阳离子[7]，对AFB1具有较强的吸附脱毒效果，吸附脱毒率达95%以上，但对极性弱或非极性物质如ZEN和DON，则基本不吸附；本公司对其经过一定方式的处理后，大大增加了蒙脱石层间的比表面积，增加了蒙脱石的孔径和孔体积，降低了蒙脱石的亲水性，从而提高了其对疏水性物质ZEN的吸附结合能力，使其不仅吸附AFB1，也吸附ZEN。

3.3 试验方法及毒素检测方法等因素的影响

目前考察霉菌毒素脱毒剂脱毒效果的方法主要有：体外吸附法和动物体内脱毒法。体外吸附法相较于动物体内脱毒法，更能直观的反映出各类脱毒产品对各种毒素的具体吸附脱毒效果；但由于大部分脱毒产品选择吸附性较差，进入动物体内后易被饲料中的某些营养成分所饱和，从而失去了对毒素的吸附脱毒作用，导致动物体内应用试验效果与体外脱毒效果差异较大。因此，为了综合评价一种脱毒产品脱毒性能的好坏，必须将体外吸附试验与动物体内应用试验相结合。霉菌毒素检测法主要有酶联免疫法（ELISA）和高效液相色谱法(HPLC)。HPLC相较于ELISA的优点是，其检测结果更准确、可靠；但缺点是对操作人员和样品中毒素纯度的要求更高，检测成本更高，无法满足大批量样品的快速检测筛选；而ELISA法检测更快速、灵敏，对样品纯度要求不高，也适应大批量样品的检测，因此本研究中主要采用ELISA法进行样品毒素含量的检测。

4 结论

体外吸附试验结果表明：10种脱毒剂中除4#、6#和7#三种脱毒剂对AFB1的吸附脱毒率较低外，其余7种对AFB1的吸附脱毒效果均较好，吸附脱毒率均在90%以上；10种脱毒剂中10#和6#吸附结合ZEN的能力较好，吸附脱毒率分别为92%和85%。综上所述，浙江三鼎科技有限公司生产的改性蒙脱石吸附结合AFB1和ZEN的能力均较好，且复合物稳定性较强，不易解吸。