离子液体［Bmim］Cl对酿酒酵母AY92022生长的影响

陈 瑞，王伟强

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012；2.皖西学院 安徽省植物生物技术实验实训中心，安徽 六安237012）

室温离子液体［1-2］是指一类室温或相近温度下完全由离子组成的有机液体化合物，简称离子液体，也称室温熔融盐。

有研究发现：用离子液体［Bmim］Cl预处理纤维素，将经离子液体预处理过的纤维素和纤维素酶混合后，加入到醋酸—醋酸钠缓冲液中，60℃下进行糖化。随着预处理温度的升高，平均糖化速度呈现先增大后减小的变化，90℃时达到最大，比未处理的提高了近70%。纤维素的聚合度［3］随预处理温度的变化与平均糖化速度的变化规律相一致。比较经离子液体处理前后纤维素的表观结构，发现纤维素出现了明显的断裂，聚合度下降。纤维素酶分子通常由催化结构域、纤维结合结构域及二者的连接区所组成，纤维素酶分子的结合结构域通过芳香族氨基酸上的芳香环和葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，再由纤维结合结构上其余氢键形成的残基与相邻纤维素链形成的氢键将单个纤维素链从纤维素聚集体表面疏解下来，然后催化域从纤维素链的末端作用，产生葡萄糖或纤维二糖［4］。聚合度的下降减少了纤维素的结晶区，增加了纤维素酶催化域的作用位点，因而提高了酶解糖化的效率。尽管离子液体［Bmim］Cl可以改变纤维素的空间结构［5］，提高其糖化效率，但离子液体的毒性目前依然研究较少。离子液体［Bmim］Cl对酿酒酵母的生长和发酵是否有影响，影响程度如何，未见相关报道。因此，本实验在适宜的温度下，研究发酵液中各种物质的变化，初步探讨离子液体［Bmim］Cl对酿酒酵母生长和发酵［6］的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种：酿酒酵母AY92022（Saccharomyces cerevisiae AY92022）

试剂：离子液体［Bmim］Cl购于河南利华制药，酵母粉、蛋白胨、氯化钠、氯化钾、硫酸、蒽酮、葡萄糖等试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌AY92022的培养

配制5组液态PDA培养基，其中1组作为对照组，不加［Bmim］Cl，其余4份加入不同质量的［Bmim］Cl，使［Bmim］Cl浓度分别为10-3g／g，10-4g／g，10-5g／g，10-6g／g。将酿酒酵母AY92022接种到100mL的液态PDA培养基中，28℃、200r／min，培养48h。

1.2.2 酵母菌数量的测定

采用分光光度计法测菌体浓度［7］。

1.2.3 还原糖含量的测定

采用蒽酮比色法［8］。

1.2.4 乙醇含量的测定

采用重铬酸钾比色法［9］。

2 结果与分析

2.1 菌体生长情况

［Bmim］Cl对酿酒酵母AY92022生长的影响见图1。

图1 ［Bmim］Cl对酿酒酵母生长的影响

其中-3，-4，-5，-6分别代表发酵液中离子液体浓度为：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，对照组的发酵液中不含有离子液体［Bmim］Cl。

从图1可以看出：与对照组一样，酿酒酵母AY92022在接种后4h内菌体浓度无变化，但很快进入对数生长期，24h左右进入稳定生长期，菌体浓度不再增加。当［Bmim］Cl的浓度小于10-6g／L时，离子液体对菌体生长的影响不大。随着［Bmim］Cl浓度的逐渐增大，菌体的数量减少。当［Bmim］Cl的浓度达到10-5g／L，酵母菌的生长受到明显影响，当［Bmim］Cl的浓度达到10-3g／L时，稳定期菌体浓度为0.0101g／mL，为对照组的63.5%，经过进一步单因素方差分析，离子液体对酿酒酵母AY92022的生长有明显的抑制作用（P＜0.05）。最后，酵母菌进入衰退期，菌体浓度下降。

2.2 葡萄糖含量变化情况

［Bmim］Cl对酿酒酵母AY92022分解葡萄糖的影响见图2。

图2 ［Bmim］Cl对酿酒酵母分解葡萄糖的影响

其中-3，-4，-5，-6分别代表发酵液中离子液体浓度为：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，对照组的发酵液中不含有离子液体［Bmim］Cl。

由图2可以看出：前4h，酵母菌在延滞期，发酵液内葡萄糖含量变化不大。在8h至24h，随着酵母菌进入生长期，葡萄糖的代谢量增加，其中对照组菌体增加最快，葡萄糖的代谢也最快。24h后，酵母菌进入稳定生长期，虽然菌体浓度不再增加，但对葡萄糖依然有较大的需求量。随着［Bmim］Cl浓度的逐渐增大，发酵液中葡萄糖的代谢量减少。当［Bmim］Cl的浓度达到10-5g／L，葡萄糖的代谢受到明显影响，当［Bmim］Cl的浓度达到10-3g／L时，葡萄糖的代谢受到的影响最大，浓度为1.59%，为对照组的2.41倍，经过进一步单因素方差分析，离子液体对酿酒酵母AY92022的生长有明显的抑制作用（P＜0.05）。

2.3 乙醇含量变化情况

［Bmim］Cl对酿酒酵母AY92022产乙醇的影响见图3。

图3 ［Bmim］Cl对酿酒酵母产乙醇的影响

其中-3，-4，-5，-6分别代表发酵液中离子液体浓度为：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，对照组的发酵液中不含有离子液体［Bmim］Cl。

由图3可以看出：前24h，菌体处于延滞期和对数生长期，葡萄糖的消耗主要用于酵母菌的生长，发酵液内乙醇含量变化不大。24h后，酵母菌进入稳定期，菌体菌浓度达到最大，酵母菌开始代谢产生乙醇。随着葡萄糖的进一步消耗，乙醇的含量快速增加，到48h时，菌体进入衰退期，菌体浓度开始下降，乙醇含量不再增加。同样，当离子液体［Bmim］Cl的浓度比较小时，发酵液中乙醇含量变化的不大，当［Bmim］Cl的浓度达到10-5g／L，此时发酵液内的乙醇产量受到明显影响，当［Bmim］Cl的浓度达到10-3g／L时，发酵液内乙 醇浓度为4.83g／L，为对照 组 的61.4%，经过进一步单因素方差分析，离子液体对酿酒酵母AY92022的生长有明显的抑制作用（P＜0.05）。

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