RP-HPLC法同时测定利明滴眼液中维生素C和维生素B1的含量

何笑荣，姜文清，霍秀颖，崔嘉芯，邹定（.卫生部北京医院药学部，北京00730；.温州医学院，浙江温州35035）

利明滴眼液是《北京医疗制剂规程》[1]收载的制剂品种，该制剂具有增强眼部局部代谢的作用，可辅助治疗早期白内障。目前，该制剂由于含维生素C和维生素B1等共10余种主、辅料，成分复杂，因此，对该制剂尚无理想有效的控制方法。虽然有文献[2]报道采用高效液相色谱（HPLC）法测定复方碘化钾滴眼剂中维生素C和维生素B1含量的方法，流动相系统以梯度洗脱方式，但这种方法在医院制剂的检测中易受到仪器条件限制；且该文献的流动相中水相的比例从100%到92%，对大多数普通的C18色谱柱而言100%水相系统会缩短色谱柱寿命。为此，笔者考虑维生素C具有易氧化的结构特点，采用在流动相系统中加0.1%硫代硫酸钠为稳定剂，并控制流动相pH在相对稳定的范围内，建立了反相高效液相色谱（RPHPLC）法同时测定利明滴眼液中维生素C和维生素B1制剂的含量方法。经方法学验证，此方法重复性好、专属性强，适合医院制剂利明滴眼液的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2695型HPLC仪、2996型二极管阵列检测器（DAD）、Empower数据处理系统（美国Waters公司）；XP-205电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SPX-250 IC微电脑人工气候箱（上海博讯实业有限公司）；Milli-Q纯水器（美国Millipore公司）。

1.2 试药

维生素B1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100390-200502，纯度：100%）；维生素C对照品（美国Fluka公司，批号：45002115，纯度：＞99.5%）；利明滴眼液（卫生部北京医院，批号：20101125、20110228、20110301，规格：每支10 mL，含量：维生素B1：1 mg·mL－1，维生素C：3 mg·mL－1）；甲醇为色谱纯，磷酸氢二铵、磷酸、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢、硫代硫酸钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇-30mmol·L－1磷酸二氢铵溶液（5∶95，用磷酸调pH值至3.2），流速：0.6 mL·min－1；检测波长：246 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备（避光操作）

2.2.1 维生素C对照品溶液。取维生素C对照品约10 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加0.1%硫代硫酸钠-流动相（1∶1）溶液（以下简称溶剂）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 维生素B1对照品溶液。取105℃干燥2 h的维生素B1对照品约10mg，精密称定，其余按“2.2.1”项下方法操作，即得。

2.2.3 硫代硫酸钠溶液。取硫代硫酸钠约0.5 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 供试品溶液。精密量取利明滴眼液1 mL置于25 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得（临用现配）。

2.2.5 阴性样品溶液。按处方（碘化钾3 g，碘化钠0.5 g，氯化钙0.6 g，维生素B11 g，维生素C 3 g，硼酸11 g，硼砂1.9 g，甲基纤维素1.5 g，硫代硫酸钠0.5 g，羟苯乙酯0.3 g，无菌用水加至1000 mL）比例称取除维生素C和维生素B1外的辅料适量，将其中羟苯乙酯置于100 mL三角烧瓶中，加适量的去离子水，加热煮沸至羟苯乙酯完全溶解，放冷，将甲基纤维素撒入该溶液中放置至完全溶解，加入除维生素C和维生素B1外的其余成分，加水至100 mL，摇匀制得阴性样品。余下操作同“2.2.4”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取阴性样品溶液、维生素C和维生素B1对照品溶液、硫代硫酸钠溶液、供试品溶液各10µL，注入色谱仪，记录色谱图；结果，维生素B1、维生素C和硫代硫酸钠的保留时间分别为5.32、6.15、3.88 min，色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数按维生素B1主峰计算大于5000，详见图1。

图1 系统适用性试验色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 专属性试验

分别精取利明滴眼液2 mL，共5份，其中3份分别置于10 mL量瓶中，分别加入0.1 mol·L－1盐酸2 mL、0.1 mol·L－1氢氧化钠2 mL和3%过氧化氢溶液5滴，放置8 h后，分别用等量的酸或碱中和。另取2份置于10 mL试管中，分别在沸水浴中加热2 h和10000 lx照度下光照8 h。将各破坏性试验溶液分别转移至10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。取以上溶液各10 μL，分别进样，记录色谱图。结果表明，各降解产物峰与主峰均能达到完全分离，维生素C和维生素B1的测定不受辅料和降解产物的干扰，维生素C和维生素B1主峰经二级管阵列检测器（DAD）均检测为单一纯峰，详见图2。

2.5 线性关系考察（避光操作）

取维生素C约75 mg和维生素B1对照品约25 mg，分别精密称定，置于不同的25 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得贮备液。将贮备液用溶剂依次分别稀释制成每1 mL中含维生素C为7.5、15、30、60、120、240、360 μg·mL－1，维生素B1为11.92、23.84、39.73、79.46、158.91、198.64 μg·mL－1的系列浓度溶液。分别进样10 μL，记录色谱图。以浓度（X，μg·mL－1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得维生素C及维生素B1的回归方程分别为：Y＝48991 X+54372（r＝0.9996），Y＝32894 X+50335（r＝0.9998），结果表明，维生素C和维生素B1的检测浓度线性范围分别为7.5～360 μg·mL－1、11.92～198.64 μg·mL－1。

图2 专属性试验色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of specificity test

2.6 精密度试验

分别制备维生素C和维生素B1低、中、高3种浓度的对照溶液，其中前者浓度分别为30、120、240 μg·mL－1，后者浓度分别为20、80、160 μg·mL－1，连续进样6次，测定维生素C和维生素B1峰面积，以峰面积的RSD计算其日内精密度；将上述溶液置于冰箱中避光保存，分别在0、1、2、3、4、5 d测定维生素C和维生素B1的峰面积。结果维生素C各浓度的日内RSD分别为1.30%、0.23%、0.43%，日间RSD分别为1.86%、1.97%、1.63%；维生素B1日内RSD分别为1.45%、0.27%、0.45%，日间RSD分别为1.38%、1.90%、1.76%，表明方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批号样品（批号：20110301）6份，按“2.2.4”项下方法制备成供试品溶液，进样测定，结果6份样品中维生素C和维生素B1含量平均值分别为2.24、1.02 mg·mL－1（n＝6），RSD分别为1.62%、1.62%。

2.8 稳定性试验

分别精密量取利明滴眼液1、1、2 mL置于50、25、25 mL量瓶中（低、中、高浓度），用溶剂稀释至刻度，在室温和低温（4℃）下避光放置，分别于0、4、8、12、24 h进样，记录色谱图，计算峰面积RSD。结果，样品在加稳定剂后常温和低温条件下均稳定，常温条件下低、中、高浓度维生素C和维生素B1的RSD分别为0.63%、0.91%、1.01%和1.12%、1.02%、0.77%；低温条件下二者RSD分别为0.63%、0.48%、0.38%和0.26%、0.58%、0.36%，表明样品溶液在24 h内基本稳定。同样条件不加稳定剂低温放置24 h，低浓度的维生素C含量的RSD为4.45%，大于2%，提示加硫代硫酸钠能增加维生素C的稳定性。

2.9 加样回收率试验

取“2.5”项下已知含量的样品，精密量取10 mL置于50 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀备用。分别精密量取120 μg·mL－1维生素C对照溶液2.5 mL、360 μg·mL－1维生素C对照溶液3 mL和6 mL置于3个10 mL量瓶中，分别精密加入2 mL上述稀释溶液，稀释至刻度，摇匀，得加入对照品低、中、高3种浓度（30、108、216 μg·mL－1）的样品溶液；同法用200 μg·mL－1维生素B1对照溶液，制备加入对照品低、中、高3种浓度（40、80、160 μg·mL－1）的样品溶液。在上述色谱条件下进样测定，计算维生素C和维生素B1的加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.10 检测限试验（避光操作）

分别精密称取维生素C和维生素B1适量，用溶剂逐步稀释，在维生素C和维生素B1浓度分别为0.75、1.1925 mg·L－1时，其信噪比（S/N）≥3，即二者检测限分别为7.5、11.9 ng。

2.11 样品含量测定（避光操作）

精密称取维生素C和维生素B1对照品适量，用溶剂溶解并稀释成每1 mL中分别约含维生素C 120µg、维生素B140µg的溶液，作为对照溶液；取利明滴眼液3批，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算维生素C和维生素B1的含量，结果见表2。

表2 3批样品含量测定结果（mg·mL－1）Tab 2 Results of the content determination of 3 batches of samples（mg·mL－1）

3 讨论

目前国内、外文献报道，维生素C含量测定方法有HPLC、紫外（UV）法等[3～5]，维生素B1有离子对色谱法、分光光度法[6，7]等。而《中国药典》2010年版二部[8]收载的维生素C制剂和维生素B1含量测定方法，由于本品处方中其他成分的干扰均不适宜本制剂。

文献[5]报道维生素C极易氧化，在水溶液中极易被氧化（可逆）成去氢抗坏血酸，氧化的速度由pH值和氧的浓度决定，还可进一步水解成不可逆的降解产物二酮古洛酸和草酸，金属离子如铜、铁、钙等可加速其氧化。本品经酸破坏、碱破坏、高温、光照、氧化破坏的结果显示，维生素C和维生素B1在酸性环境较为稳定，在碱性环境、加热及光照条件下稳定性较差，尤其对氧化剂不稳定。维生素C在pH4.0最易氧化，在pH3.0和pH6.0时最稳定，故分析测定时尽量控制在pH3左右，制剂成品pH控制在6左右[5]。本品含量测定结果发现维生素C的含量偏低，维生素B1含量正常，可能与利明滴眼液在制备过程和放置过程中部分维生素C发生分解有关，提示本品应在低温、避光、处方中加还原剂的条件下贮存则相对稳定。

稳定性试验结果显示，在样品溶液稀释过程中，溶媒中加0.1%硫代硫酸钠溶液能明显改善样品中维生素C的稳定性，样品溶液室温与冷藏放置24 h的稳定性结果基本一致；样品与维生素C和维生素B1对照品溶液的稳定性试验结果显示，2种维生素对照品溶液比样品溶液稳定，分析可能与处方中含有的金属离子钙离子加速维生素C的氧化有关。

本试验的色谱条件选择是根据维生素C结构上有暴露的羟基，易与C18色谱柱上未被键合的硅醇基团发生相互作用，且金属离子加速维生素C的氧化的特点，流动相优先选择甲醇与磷酸二氢铵配伍。前期试验分别考察了10、20、25、30、40、50 mmol·L－1等不同浓度的磷酸二氢铵溶液（pH 3.5）与甲醇配比时，维生素C、维生素B1与样品中各成分的分离效果。结果随离子浓度的升高其分离度增加，当大于30 mmol·L－1时，分离度降低，最终确定磷酸二氢铵的浓度为30mmol·L－1。将30 mmol·L－1磷酸二氢铵溶液分别调节成2.5、3.0、3.2、3.5、3.8、4.0不同pH的溶液，考察不同pH对分离度的影响，结果确定30 mmol·L－1磷酸二氢铵的最佳pH值为3.2，其分离度为5.7，峰的对称因子在0.95～1.05之间，峰的理论板数在上述条件下相对较高。

从DAD检测得到的紫外吸收光谱可见，维生素C和维生素B1分别在244、246 nm波长有最大吸收，由于利明滴眼液的处方中维生素B1的含量小于维生素C的含量，故选择246 nm为检测波长。

本试验先后采用了3种色谱柱即Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Alltima C18（150mm×4.6mm，5μm）和Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行考察，结果均可达到分离度要求，可见此色谱条件对色谱柱无明显选择性。

本试验所建立的RP-HPLC法，可同时测定利明滴眼液中维生素C和维生素B1的含量，方法简便、灵敏、准确，经过方法学考察验证，可以用于该制剂的质量控制。

[1]北京市卫生局.医疗单位制剂规程[M].北京：人民卫生出版社，1984：270.

[2]何梅凤，吴 伟，唐细兰，等.高效液相色谱法测定复方碘化钾滴眼液中维生素的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27（11）：1619.

[3]成志强，孙成均，黎源倩.反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素[J].分析化学，2001，29（9）：1068.

[4]Tee ES，Khor SC.Simultaneous determination of B-vitamins and ascorbic acid in multi-vitamin preparations by reversed-phase HPLC[J].Mal J Nutr，1996，2（2）：176.

[5]张 爽，张 华，赵思奇.维生素C稳定性紫外分光光度测定法的建立[J].黑龙江医药，2008，21（1）：26.

[6]Markopoulou CK，Kagkadis KA，Koundourellis JE.An optimized method for the simultaneous determination of vitamins B1，B6，B12in multivitamin tablets by high performance liquid chromatography[J].J Pharm Biomed Anal，2002，30（4）：1403.

[7]刘树恒.间接光度法测定药物中维生素B1[J].理化检验-化学分册，2010，46（5）：557.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：896、901.