猴STLV病毒gag蛋白在昆虫细胞中的表达

王 琼 张利仙 李维薇 李 冰 艾 军 周晓黎

（1.中国科学院昆明动物研究所，昆明 650223；2.大理洱海湖泊研究中心，大理 671000；3.云南出入境检验检疫局，昆明 650228）

非人灵长类动物由于其与人类相似的生物和行为特征，成为解决人类健康和疾病问题的理想动物模型[]。随着国际市场对实验猴需求量的增加，对实验猴也提出了严格的要求，实验猴从普通级别向SPF（无特定病原体）猴发展[]。1992年，中华人民共和国卫生部颁布的《医学实验动物标准》规定，STLV-1型是SPF实验猴必须排除的病毒之一。自从1982年首次在非人灵长类动物发现存在自然发生的HTLV相关病毒之后，从世界各地的非人类灵长类动物中发现许多猿猴T细胞淋巴细胞白血病病毒（STLV）的不同谱系（STLV-l、STLV-2、STLV-3）[1-2]。猴嗜T淋巴白血病病毒（Simian T-lymphotropic virus，STLV），它与人T淋巴白血病病毒（Human T-lymphotropic virus，HTLV）统称为灵长类嗜T淋巴细胞病毒（Primate T-lymphotropic virus，PTLV），属于RNA肿瘤病毒亚科，δ逆转录病毒属[3]。STLV 与恶性淋巴瘤、淋巴组织增生等疾病具有相关性，但大多数情况下，感染了STLV的猕猴仅仅作为病毒携带者而在相当长一段时期内表现为无症状状态。大量的文献报道，STLV不仅可以在非人灵长类间传播，还可以传播给人类。

中国是世界上灵长类资源丰富的国家之一，随着国际市场对灵长类资源的需求量的增大，同时对出口的灵长类动物提出严格的检疫要求。STLV病毒的存在不仅影响实验猴的质量，而且对饲养人员和实验人员的健康也存在很大的隐患。目前，对STLV病毒的检测方法主要有病原分离、PCR、荧光免疫及ELISA方法。在进出口贸易的检疫中，一般采用的是血清学检测法，一种方法是采用细胞系对分离到的病毒进行培养，然后收集其分泌液作为抗原来检测猴群中血清STLV抗体的含量，这种方法不但成本较高而且对工作人员的安全有较高的威胁；另一种方法是使用商品化的试剂盒来检测STLV病毒，现在市场上使用较多的是用HTLV的相应抗原作为诊断抗原，这种方法特异性不够高[4]。因此建立一种方便、快捷、灵敏度高、特异性强、经济节约的检测方法是必要的。

本实验通过人工合成STLV病毒保守基因gag，构建昆虫杆状病毒表达载体，并转染sf9细胞，成功表达出猴STLV病毒gag蛋白，为以基因工程抗原为基础的猴STLV病毒ELISA检测方法的建立奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 质粒和菌种

Pbluescriptsk-gag（携带人工合成的猴嗜T淋巴白血病病毒STLV gag 基因）其gag基因参照序列genbank（登录号：AY590142），由上海生工合成。pFastBacHTB质粒、ECoil.Top10和DH10Bac菌株，为云南出入境检验检疫局动检实验室保存。

1.2 主要的试剂和仪器

质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于AxyGEN公司，限制性内切酶BamHI和HindIII、DNA Marker、T4连接酶购于TaKaRa公司；Cellfectin转染试剂盒购自invitrogen公司；胎牛血清、Grace，s 细胞培养基购自GBICO公司；抗HIS单抗购自天根生化科技有限公司，山羊抗小鼠IgG/辣根酶（HRP标记）购自Southern Biotech公司；PCR仪是eppondoff。其他试剂及仪器均为商业公司购买。

1.3 引物设计与合成

根据S T L V g a g基因碱基序列设计了两对引物，其中，S015-CGGCGAGAATACCAGCAACT-3，S02：5-TTCCAGTGGGTTGGGTCTTG-3，跨幅452bp，用于gag的鉴定；S1：5-TTTGGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTT -3，S2 5-CCCAAGCTTTTAAGCCTCCCCCCCT -3，下划线部分分别为BimHI和HindIII酶切位点，跨幅1395bp用于扩增STLV gag基因；通用引物（M13）序列参照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统使用手册，以上引物均由invitrogen公司合成。

1.4 pFastBacHTB-gag重组质粒的构建

用引物S1和S2，以Pbluescriptsk-gag质粒为模板，通过PCR扩增得到gag基因片段。通过BamHI和HindIII酶双酶切，与用相同的酶切处理的昆虫表达载体pFastBacHTB连接。连接产物转化TOP10感受态细胞，经过庆大霉素和氨苄青霉素培养基筛选，提取质粒，通过对重组质粒进行PCR扩增、酶切和测序鉴定，表明获得了重组质粒pFastBacHTB-gag。

1.5 重组质粒 pFastBacHTB-gag的转座

将阳性质粒 pFastBacHTB-gag转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，构建杆状病毒表达载体，通过卡那霉素、四环素和庆大霉素筛选重组转座子Bacmid-gag，提取杆粒，分别用M13引物和引物S01/S02进行PCR鉴定。

1.6 重组杆粒在昆虫细胞中的表达及重组蛋白的鉴定

提取转座杆粒Bacmid-gag，按Cellfection转染试剂说明书转染sf9昆虫细胞，在28℃培养96h后，反复冻融细胞，收集上清液并盲传3代，将反复冻融细胞后得到的上清液进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。

2 结果

2.1 重组质粒pFastBacHTB-gag的鉴定

重组质粒pFastBacHTB-gag 经 BamHI和HindIII酶切处理后，回收gag基因片段，与经过相同酶切处理的pFastBacHTB载体相连，转化TOP10感受态细胞，得到重组质粒pFastBacHTB-gag。该质粒用引物S01/S02对其进行扩增，扩增产物为452bp（见图1泳道2），与理论值相符。同时经BamHI和HindIII双酶切，酶切产物分别为1395bp和4766bp（见图1泳道1），均与理论值相符。

图1 pFastBacHTB-gag双酶切及PCR鉴定

2.2 转座杆粒的PCR鉴定

pFastBacHTB-gag转化DH10Bac感受态细胞，经庆大霉素、卡那霉素、四环素筛选后，提取其重组杆粒Bacmid-gag，分别用M13引物和S01/S02引物对其进行PCR鉴定，扩增产物分别为3825bp（见图2泳道1和2）和452 bp（见图2泳道3），表明获得了转座的杆粒。

图2 重组杆粒Bacmid-gag的PCR鉴定结果

2.3 重组蛋白gag的鉴定

重组杆粒Bacmid-gag转染sf9 昆虫细胞96 h后，取其上清液感染昆虫细胞，并盲传3代后，将反复冻融细胞后得到的上清液进行SDS-PAGE及Western blot鉴定，结果如图3（条带1和2）、4所示，结果表明成功的获得重组gag蛋白。

图3 gag 重组蛋白的SDS-PAGE 鉴定

图4 gag 重组蛋白的western blot鉴定

3 讨论

本研究提出一种能在昆虫细胞中成功表达STLV病毒gag基因的方法，这一方法的优势在于三点：一是人工合成STLV病毒保守基因gag，避免直接接触活病毒的培养；二是表达载体pfastbacHTB上的6xHis 标记，组氨酸标签的优点在于它在非变性（能保持蛋白质的构象和功能）和变性（包涵体形式的蛋白质）条件下都能有效地工作，因此表达载体上的6xHis 标记为表达出的蛋白的纯化提供了方便。三是昆虫细胞表达系统具有原核细胞无法比拟的优点：表达量高且对蛋白的后加工系统与哺乳动物细胞接近，能识别与切除信号肽，能对表达的蛋白进行切割、磷酸化、糖基化等修饰，表达的外源蛋白接近天然蛋白，具有很高的生物学活性。

国内学者卢爱桃等人用原核表达系统成功表达出了STLV病毒gag重组蛋白，以表达抗原建立其ELISA检测方法，结果表明所建立的方法检测自然感染的笼养恒河猴血清中STLV-1抗体取得了良好的效果。

本实验正是基于卢爱桃等人的研究结果，结合昆虫细胞表达系统的优良特点，通过构建昆虫细胞表达载体，成功地在昆虫细胞中表达出猴STLV病毒gag蛋白，为建立基因工程抗原为基础的猴STLV病毒ELISA检测方法奠定基础。

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