一例弥漫性大B淋巴细胞瘤组织样本T细胞TCRα/β CDR3谱序的初步分析＊

孙永苹，汤贤英，朱红倩，杨雪峰，姚新生

(1．遵义医学院 珠海校区临床教学部，广东 珠海 519100;2．遵义医学院 免疫学教研室，贵州 遵义 563099;3．贵州省人民医院 血液内科，贵州 贵阳 550002;4．遵义医学院附属医院 胃肠外科，贵州 遵义 563099)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占全部 NHL的30% ～40% 。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是目前发病率增长速度最快的恶性肿瘤，现已占我国常见恶性肿瘤发病率的第八位，尽管近年来新的治疗策略在一定程度上提高了淋巴瘤的疗效，但仍有部分淋巴瘤采用常规治疗方案不能被治愈。近年来，已证实在白血病患者外周血 αβT 细胞 TCR CDR3 存在克隆性增殖［1－3］，研究克隆性增殖可以了解白血病的发病和免疫应答机制，进而为白血病的治疗提供基础。FQPCR溶解曲线分析技术，可较好的用于临床样本TCR CDR3谱系的初步分析［4，5］。为研究淋巴瘤的免疫应答机制，初步了解其TCR CDR3克隆性增殖特点，本实验采集了1例弥漫性大B淋巴细胞瘤患者和4例淋巴结增生志愿者组织样本，利用FQ－PCR技术初步分析样本中TCR Vα和TCR Vβ各家族CDR3谱系的整体情况，为淋巴瘤免疫应答机制的进一步研究提供基础。

1 材料与方法

1．1 标本与试剂 经细胞形态学，组织化学等诊断为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者1例，取其淋巴瘤组织标本(由贵州省人民医院提供)，4例淋巴结炎患者淋巴结组织(2男，2女)标本作为对照(由遵义医学院第一附属医院提供)。mRNA提取试剂盒(TIANGENG公司)，cDNA合成 kit(MBI，Fermentas公司)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)等;Jurkat细胞(购自中南大学湘雅医学院中心实验室)。

1．2 引物设计与合成 引物参照文献［6，7］合成，合成人TRAV基因家族的34条上游引物，及1条共同的TRAC下游引物;合成人TRBV基因家族的26条上游引物，及1条共同的TRBC下游引物;作为对照的GAPDH上游及下游引物，上述所有引物均由inviogen上海英骏生物技术有限公司合成。

1．3 mRNA提取和cDNA合成 按照mRNA提取试剂盒进行操作，提取Jurkat细胞、4例淋巴结炎和1例淋巴瘤组织中的mRNA，按cDNA合成kit条件，用Oligo dT作引物扩增cDNA(每个样本合成4个反应管，每管20μl)。

1．4 FQ－PCR扩增 TCRVα和 TCRVβ各家族CDR3区段的cDNA

1．4．1 FQ－PCR扩增TCRVα32个家族CDR3区段的cDNA FQ－PCR扩增反应体系 每个样本做36个PCR反应管，1－34管为样本反应管，35管为GAPDH对照管，36管为无引物对照管;第1－34管分别加入TRAV1至TRAV32(期中TRAV1和TRAV4各有两个亚家族)上游引物1μl，1－34管每管加入TRAC下游引物1μl，第35管加GAPDH上、下游引物;1－36管分别加样品cDNA 1μl，1－36管每管加入荧光定量Mix 10μl、纯水7μl(第36管加9μl纯水)，总体积20μl。选取Jurkat细胞株的GAPDH表达量的相对量标准作为标准曲线。

FQ－PCR扩增反应条件:①扩增:94℃ 3 min，1 cycles;94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 50 sec，45 cycles;72℃ 10 min，1 cycles;②溶解曲线分析:75℃ －95℃间以0．2℃/秒读取一个荧光值，100 cycles;③FQ－PCR产物取8μl做1．5%琼脂糖凝胶电泳，其余样本－20℃保存备用。

1．4．2 FQ －PCR 扩增 TCRVβ24家族 CDR3区段cDNA FQ－PCR扩增反应体系 样本共做28个反应管，1－26管为样本反应管，27管为GAPDH对照管，28管为无引物对照管;第1－26管分别加入TRBV1至TRBV24(期中TRBV5和TRBV13各有两个亚家族)上游引物各1μl，1－26管每管再加入TRBC下游引物1μl;第27管加GAPDH上、下游引物各1μl;1－28管每管再加入样品cDNA 1 μl;1－28管每管加入荧光定量Mix 10μl、纯水7 μl(第28管加9μl纯水)，总体积20μl。选取Jur-kat细胞株的GAPDH表达量的相对量标准作为标准曲线。

FQ－PCR扩增反应条件:①扩增:94℃ 3 min，1 cycles;94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 50 sec，45 cycles;72℃ 10 min，1 cycles;②溶解曲线分析:75℃ －95℃以 0．2℃/秒读取一个荧光值，100 cycles;③FQ－PCR产物取8μl做1．5%琼脂糖凝胶电泳，其余样本－20℃保存备用。

1．5 普通PCR扩增 从Vα、Vβ链FQ－PCR溶解曲线中选取单峰家族TRAV 10、TRAV 18、TRBV 6、TRBV 24进行普通PCR扩增。普通PCR反应体系:取 FQ－PCR产物1μl，加入相应的 TRAV/TRBV上游引物2μl(引物浓度均为10 mmol/L)和相应 TRAC/TRBC下游引物2μl，加入 Taq DNA Polymerase 0．25 μl，2 mM dNTP 5 μl，10 × Buffer with KCL，25 mM MgCl2 3 μl，DDW 30．75 μl;总反应体积50μl;普通 PCR反应条件:α链:①95℃ 2 min，1 cycles;② 95℃ 30 sec，60℃ 1min，72℃ 1 min，35 cycles;③72℃ 10 min，1cycles;β链:① 94℃ 3 min，1 cycles;②94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35 cycles;③ 72℃ 10 min，1cycles。扩增产物经普通琼脂糖凝胶回收后送测序。

2 结果

2．1 1例弥漫性大B淋巴细胞瘤和4淋巴结增生组织标本34个TRAV家族和26个TRBV家族CDR3谱型FQ－PCR产物在1．5%琼脂糖凝胶电泳上，各家族CDR3在预测位置处显示条带。(图1为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRAV各家族的电泳结果;图2为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRBV各家族的分析结果)。

2．2 4例淋巴结增生组织标本中32个TRAV家族和24个TRBV家族CDR3谱型的FQ－PCR产物各家族相对定量表达不一，各家族CDR3谱型的溶解曲线图显示为多个峰型图(多克隆和寡克隆);弥漫性大B淋巴细胞瘤患者组织32个TRAV家族和26个TRBV家族CDR3谱型的FQ－PCR产物各家族相对定量表达不一，部分TRAV和TRBV家族表现为单峰，极少家族表达极低(图3为淋巴结增生－1组织标本TRAV各家族的分析结果，其它未列出;图4为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRAV各家族的分析结果;图5为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRBV各家族的分析结果;淋巴结增生组织标本TRBV各家族的分析结果未列出;图6为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRAV10测序结果;图7为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRAV18测序结果;图8为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRBV6测序结果;图9为弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRBV24测序结果)。

2．3 1例弥漫性大B淋巴细胞瘤患者中TRAV和TRBV单峰家族CDR3区测序的基因及氨基酸的组成不同(见表1)。

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图9 弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRBV24测序结果

3 讨论

近年来，淋巴瘤的临床治疗已经取得了一定的疗效，明显延长了患者的生存时间，但微小残留病变仍然是患者复发死亡的重要原因。寻找肿瘤特异性CTL用作过继免疫治疗将为淋巴瘤微小残留病变的治疗提供新的途径，而对成熟的T(或B)细胞肿瘤，可望通过将细胞表面的TCR CDR3序列(或BCR CDR3)作为一种特异的靶标，用于淋巴瘤治疗或研制独特型疫苗。目前，通过体外扩增或各种转基因技术研制的肿瘤相关特异性CTL已经应用到白血病的治疗［8，9］。FQ －PCR技术作为一种客观、直观的先进技术，可以对多种疾病中T细胞的TCR CDR3谱系进行初步的筛选［10］。

本文研究分析了4例淋巴结增生组织和1例弥漫性大B淋巴细胞瘤患者TRAV和TRBV各家族的CDR3谱序，研究发现4例淋巴结增生的TCR CDR3亚家族溶解曲线图均为寡峰和多峰图;本实验1例弥漫性大B淋巴细胞瘤患者淋巴结组织αβT细胞TCR CDR3谱系分析发现:TCR alpha链AV10、AV18;TCR beta 链 BV6、BV24 家族出现较明显的单峰图，提示该单峰家族T细胞可能为机体在肿瘤相关抗原持续刺激下所产生的一种应答T淋巴细胞的克隆;对呈单峰家族的CDR3进行了测序分析，其基因和氨基酸组成不一致，提示这种克隆增殖的T细胞可能针对肿瘤B细胞不同表位应答产生的克隆性增殖。本实验的技术和初步数据为进一步研究淋巴溜的应答机制和个体化的抗肿瘤T细胞治疗提供了基础。

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