碳纳米管修饰电极测定冬虫夏草有效成分含量

申 远 陈乐玥 华 欣 申贵隽＊ 于爱民

（1吉林大学 化学学院，长春130012；2大连大学 人才建设办公室，大连116622；3大连大学 医学院，大连116622；4大连大学 环境与化学工程学院，大连116622）

1 前言

冬虫夏草是中国传统的名贵中药，为麦角菌科真菌冬虫夏草（CordycepssinensisSace），寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。因其价格昂贵，目前市场上常有伪品亚香棒虫草出现，其来源为麦角科真菌霍克斯虫草（CordycepshawkesiiGray），寄生在鳞翅目昆虫幼虫的子囊菌，由虫体和头部长出的子座组成。真品冬虫夏草含有核苷、多糖、甾醇、氨基酸等多种活性成分，传统中医认为具有补肺益肾、止血化痰等功效。除此之外还具有调节免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种药理作用［1－2］。核苷类物质（腺苷、尿苷、鸟苷）为冬虫夏草有效成分之一，尤以腺苷具有明显的药理作用，2005年版《中国药典》［3］将其作为指标成分应用于冬虫夏草的质量控制中。

近年来，市场上随着冬虫夏草类保健品数量的增多，其有效成分分离、测定的研究也变得十分活跃。有报道水溶性核苷类成分主要集中在子座部分，虫体含量甚低，并且从子座的水浸液分离得到微量的次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和核苷［4］。有人从西藏产冬虫夏草中分离得到了尿嘧啶、腺嘌呤和腺嘌呤核苷［5］。刘静明等从我国长春蛹冬虫夏草菌丝中分离得到腺苷、腺嘌呤和冬虫夏草素，其中腺嘌呤和冬虫夏草素首次从菌丝体中分离得到［6］。陈玉婷等用RP－HPLC法测定了子座（即幼虫子座）、虫体（即幼虫尸体）和全草（即幼虫子座和幼虫）中腺嘌呤核苷的含量［7］。郭怀忠等用整体毛细管电泳柱测定了冬虫夏草中胞苷与腺苷的含量［8］。由于这些方法涉及仪器昂贵而且操作复杂、测试成本高，为此采用多壁碳纳米管修饰电极［9－11］，依据循环伏安法技术测定冬虫夏草胶囊中腺嘌呤核苷的含量。研究结果与色谱方法相比，不仅灵敏度高、简单、快速、重现性好、干扰小，而且节能、环保，无污染物排放。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ZF－4电位扫描信号发生器、ZF－10B数据采集存储器、ZF－9恒电位或恒电流仪均购自上海正方电子电器有限公司，AS230型数控超声波清洗器（奥特宝恩斯仪器公司），AL204型电子天平（上海梅特勒－托利多仪器有限公司），PH2C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂），金电极和饱和甘汞电极购自上海辰华仪器公司，铂丝电极。

多壁碳纳米管（MWNT）购自中科院成都有机所，N，N－二甲基甲酰胺（DMF）和腺苷均购自国药集团化学试剂有限公司，冬虫夏草胶囊购自天津天狮生物制品有限公司，磷酸盐缓冲溶液（PBS），其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

2.2 MWNT的纯化与功能化

将MWNT在浓盐酸中超声7.5h进行纯化，纯化后的MWNT加浓硝酸在140℃下回流8h，用二次蒸馏水洗至中性，100℃烘干研成粉末，备用。

2.3 MWNT／Au修饰电极的制备

称取2.2中所得功能化的MWNT粉末2.0mg超声分散于10mL DMF中，形成黑色悬浊液备用。把金电极先用0.05μm Al2O3抛光粉抛光成镜面，然后依次在蒸馏水、硝酸（1＋1）水溶液、无水乙醇、蒸馏水中分别超声3min，用微量进样器取定量的悬浊液滴加在金电极表面，红外灯下烘干，得MWNT／Au修饰电极。实验表明，当悬浊液的浓度从0.2mg／mL增加到1.0mg／mL时峰电流显著增大，当由1.0mg／mL增加到2.5mg／mL时，峰电流逐渐降低，这是由于富集物厚度过大，阻碍了腺苷与电板的电子交换，因此MWNT用量以2.5mg／mL为最佳。

2.4 实验方法

在（25±2）℃下，采用三电极体系：以MWNT／Au修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极。以循环伏安法研究了腺苷在不同条件下 MWNT／Au电极上的化学行为，用循环伏安法研究了峰电流与腺苷浓度的线性关系及最低检出限，并用标准曲线法测定了腺苷样品含量。

3 结果与讨论

3.1 电极修饰前后对比

图1中曲线A、B分别是裸Au电极和MWNT／Au电极在pH值为7.0的PBS底液中腺苷浓度为50nmol／L时的循环伏安（CV）图，由CV图可以看出，A图出现了两个波峰，无法定量分析，B图有良好波形。

3.2 扫描速率的影响

腺苷（50nmol／L）在pH 值为7.0的PBS底液中进行CV测定。扫描速率从5mV／s开始依次增加至200mV／s时，峰电流增加，还原峰电位负移。实验结果表明，在扫描速率为100mV／s时，有良好的还原峰，结果见图2。

图1 腺苷（50nmol／L）在裸金电极和碳纳米管修饰金电极上的循环伏安图Figure 1. Cyclic voltammograms of 50nmol／L adenosine recorded using a bare gold electrode and a MWNT modified gold electrode.

图2 不同扫描速率时腺苷的循环伏安图Figure 2. Cyclic voltammograms of adenine at different scanning rates.

3.3 底液的选择

按如前所述的电化学方法，在磷酸、醋酸钠－醋酸和PBS等不同种底液条件下分别对腺嘌呤核苷的电极氧化还原过程进行了对比实验。结果发现只有腺苷在PBS缓冲溶液中出现良好的还原峰，结果见图3。

3.4 碳纳米管修饰液浓度的选择

分别对比实验了在修饰液浓度为：0.5，1.0，1.5，2.0和2.5mg／mL 时腺嘌呤核苷的电化学响应状态。结果发现，在金电极上修饰不同浓度的多壁碳纳米管时，出现了不同形状的还原峰，当碳纳米管的浓度为1mg／mL时，其峰电流最大而且峰型最佳、重现性也最好。

3.5 底液pH值对极化电流的影响

实验发现，腺嘌呤核苷在底液PBS为不同的pH值情况下会出现不同形状的还原峰。当PBS的pH值为7.0时，其峰型和极化电流值最佳，结果见图4。

图3 腺嘌呤核苷在不同底液中的循环伏安图Figure 3. Cyclic voltammograms of adenine in different buffer solutions.

图4 不同酸度底液的循环伏安图Figure 4. Cyclic voltammograms of adenine in the buffer solutions at different pHs.

3.6 线性范围、重现性和稳定性

在优化的实验条件下，分别依次检测浓度为1.0×10－1，1.0×10－2，1×10－3，1.0×10－4，1.0×10－5，1.0×10－6，1.0×10－7，1.0×10－8和 1.0×10－9mol／L腺嘌呤核苷的极化电流。实验结果表明，腺嘌呤核苷的最高氧化峰电流与其浓度在1.0×10－1～1.0×10－8mol／L的范围内有良好的线性关系，线性方程：I（mA）＝0.0431－0.0046C（mol／L），相关系数R2＝0.9947。

将该修饰电极室温下保存14d，其氧化峰电流基本不变。对于1.0×10－4mol／L的腺嘌呤核苷溶液，连续平行测定5次的相对标准偏差（RSD）为2.8%，检出限为1.0×10－6mol／L。

3.7 样品含量的测定

按上述优化的实验条件取5个不同批次样品进行平行测定，所得实验数据结果处理见表1。实验结果表明，所测5个批次样品的平均回收率为101.5%，RSD为1.5%。该产品标示含量与所测结果基本相符，可以认为所测定样品质量合格。

表1 冬虫夏草胶囊中腺嘌呤核苷含量的测定结果Table 1 The determination results of adenine contents in Cordyceps sinensis capsules

4 结论

用滴涂法制备了一种多壁碳纳米管修饰金电极并研究了腺嘌呤核苷在修饰电极上的电化学行为。研究结果表明，以1mg／mL的碳纳米管修饰金电极为工作电极、铂片电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，在pH为7.0的PBS底液中，当扫描速率为100mV／s时腺嘌呤核苷的极化电流较高并且峰形最佳，适合定量分析。在优化的实验条件下测得其极化电流与腺嘌呤核苷浓度在1.0×10－4～1.0×10－8mol／L 范围内呈良好的线性关系 （R2＝0.9947），检出限为1.0×10－9mol／L。所测的5批样品的平均回收率为101.5%，RSD为1.5%。与同类方法相比，该方法具有灵敏度高、简单、快速、重现性好，干扰小等特点。实际样品的对照分析结果令人满意。

［1］李绍平，李萍，季晖，等.天然与发酵培养冬虫夏草中核苷类成分的含量及其变化［J］.药学学报，2001，36（6）：436－439.

［2］李绍平，季晖，李萍，等.冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展［J］.中草药，2001（4）：373－375.

［3］国家药典委员会.中国药典：一部［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［4］徐文豪，薛智，马建民.冬虫夏草的水溶性成分－核苷类化合物的研究［J］.中药通报，1988，13（4）：34－36.

［5］吕瑞绵，杨永春，岳德超，等.虫草菌1号深层培养产物的化学成分［J］.微生物学通报，1981，16（9）：166－168.

［6］刘静明，钟裕容，杨智，等.蛹虫草化学成分研究［J］.中国中药杂志，1989，14（10）：32－35.

［7］陈玉婷，朱曼萍，王丹红，等.HPLC测定冬虫夏草不同药用部位腺苷的含量［J］.中国中药杂志，2007，9（5）：857－858.

［8］郭怀忠，毕开顺，孙毓庆.毛细管电色谱及其在药物分析中的应用［J］.药物分析杂志，2005，25（6）：735－741.

［9］侯晓兰，申贵隽，孟梁，等.多巴胺和抗坏血酸在十六烷基三甲基溴化铵／碳纳米管电极上的检测［J］.分析试验室，2010（11）：87－90.

［10］Hou Xiaolan，Shen Guijun，Meng Liang，et al.Multiwalled Carbon Nanotubes Modified Glass Carbon Electrode andits Electrocatalytic Activity towards Oxidation of Paracetamol［J］.Russian Journal of Electrochemistry，2011，11（47）：1262－1267.

［11］刘冠山，侯晓兰，申贵隽 .对乙酰氨基酚在多壁碳纳米管修饰电极上的电化学行为［J］.分析科学学报，2010（6）：681－684.