联合检测血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表达对乳腺癌早期微转移的诊断价值

张 琼* 谭小军 高蔚樱

（广州医学院附属肿瘤医院病理科，广东 广州 510095）

乳腺癌是一类严重危害妇女健康的主要恶性肿瘤。引起乳腺癌患者死亡最主要原因是远处播散、转移。瘤细胞进入外周血中的微转移是肿瘤远处转移的必需步骤本研究利用荧光定量PCR技术，以人乳腺珠蛋白（hMAM）、细胞角蛋白19（CK19）、癌胚抗原（CEA）、乳腺上皮黏蛋白（SBEM）作为标志，检测乳腺癌患者外周血中的循环肿瘤细胞，并初步探讨其在微转移检测中的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2011年1月至2011年12月我院治疗的乳腺癌患者外周血标本100例。乳腺纤维腺瘤患者血标本70例及健康志愿者血标本l0例作为对照。所有患者均术前采血，术前均未经化疗、放疗等任何治疗。

表1 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表达联合检测结果

1.2 主要试剂、仪器

抽提总RNA的Trizol试剂购自Gibco BRL公司，SYBR Premix Ex Tag（Perfect Real Time）购自Takara公司，Lightcycler PCR热循环仪购自Roche公司。hMAM上游引物5'-CCGACAGCAGCAGCCTC AC-3',下游引物5'-TCCGTAGTTGGTTTCTC AC-3'；CK19上游引物5'-CTGAGTGACATGCGAAGCCAATA-3',下游引物5'-ATCTTCCTGTC CCTCGAGCA-3'；CEA上游引物5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAGGAAGAAGC-3',下游引物5'-GGGCCACTGTGGGCATCATGA TTGG-3'；SBEM上游引物5'-CTGCCCAGAATCCGACAACAG-3',下游引物5'-AGCAGTGGTCGCAGTGGTTGC-3'；β-actin上游引物5'-TTGCCGACAGGATGCAG AAGGA-3',下游引物5'-AGGTGGACAG CGAGGCCAGGAT-3'。以上引物均由Primer 5软件设计，并由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取

取静脉血5mL（弃去开始的1 mL，以防上皮细胞的污染），EDTA （1mg/mL）抗凝，生理盐水稀释2～3倍，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，采用Trizol提取细胞总RNA用于检测。

1.3.2 荧光定量PCR检测

按照SYBR Premix Ex Tag试剂盒说明。反应体系20μL，包括cDNA模板2μL（阴性对照以蒸馏水代替），上下游引物各0.4μL，SYBR Premix Ex TaqTM染料10μL。在Lightcycler PCR热循环仪上进行扩增和分析，扩增参数为： 50℃ 2min，95℃ 10min后;再94℃ 15 min，66℃ 1min，40次循环。

1.4 结果计算

表达量计算方法根据比较阈值法推导出目的基因的量= 2-△△Ct（cycle of threshold.Ct）。＞2判为阳性[1]。

1.5 统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较用t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表达

乳腺癌组外周血hMAM、CK19、CEA和SBEM mRNA的阳性表达率分别为43%、36%、31%和46%；而乳腺纤维腺瘤患者CK19 mRNA的阳性表达率为8.10%，CEA mRNA的阳性表达率为2.86%，hMAM和SBEM未检出；健康志愿者外周血中均未检出。这4种标志物在乳腺癌患者外周血中的阳性表达率均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表达联合检测对乳腺癌微转移的诊断价值

单项检测敏感度为31%一46%，4项联合检测对乳腺癌诊断的敏感度及准确性明显升高（表1），差异具有统计学意义（P＜0.05），特异性改变无统计学意义。

3 讨 论

肿瘤细胞进入外周血中的微转移是肿瘤远处转移的前提。以往研究多为探讨单个微转移标志物的作用，但乳腺癌的微转移是一种多基因、多阶段、多因素作用的结果，单一的一种诊断指标往往不够。综合应用多个指标通常可以弥补单一指标的敏感性或特异性不高的缺点，有效地提高其诊断准确率。

研究证实[2]hMAM mRNA的表达仅限于成人的乳腺组织和乳腺癌细胞株，在乳腺癌原发灶中的表达明显高于正常乳腺组织，在正常淋巴结或外周血白细胞检测不到hMAM mRNA的表达，可用于乳腺癌微转移的检测[3]。CK19表达于正常上皮及上皮源性原发肿瘤及其转移肿瘤细胞，而血细胞无CKl9表达的细胞，可作为检测循环癌细胞指标[4,5]。CEA过表达于消化道肿瘤、乳腺癌等肿瘤中，血清CEA水平与乳腺癌患者的导管受累情况、淋巴结转移数和肿瘤分期有关[6,7]。SBEM是一种新的用于检测乳腺癌微转移的标志物[8]，仅在乳腺和唾液腺中表达，常常高表达于阳性淋巴结。

本研究资料显示，乳腺癌患者外周血中hMAM、CK19、CEA和SBEM mRNA阳性表达率均明显高于对照组，表明4种标志物对于检测乳腺癌外周血循环肿瘤细胞具有较高的特异性。本研究中，单项指标对乳腺癌微转移诊断的敏感度均较低，而4种标志物联合检测对乳腺癌微转移诊断的敏感度及准确性明显升高，同时又保持了较高的特异性，提示联合检测hMAM、CK19、CEA和SBEM可有效避免单一指标造成的遗漏，提高对乳腺癌微转移的诊断正确率，因此可以作为一种检测外周血循环肿瘤细胞的有效方法，有助于指导临床合理用药、判断预后，是提高患者生存率的关键。

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