荧光定量PCR分析儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性

周建峰 夏献颗 陈 平

湖南省湘潭县人民医院，湖南湘潭 411200

荧光定量PCR分析儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性

周建峰 夏献颗 陈 平

湖南省湘潭县人民医院，湖南湘潭 411200

目的 了解儿童感染EB病毒（EBV）后外周血中异型淋巴细胞（异淋）的比值。 方法 荧光定量PCR测定外周静脉血的EBV拷贝数；确定EBV感染后，分3组：EBV感染组、住院对照组、健康对照组，各100例，取外周血涂片染色，进行白细胞分类计数，统计异淋比值。 结果 EBV感染组异淋为（5.7±3.3）%，与住院对照组[（2.1±1.2）%]比较， 差异有高度统计学意义（P<0.01）；与健康对照组[（1.0±0.9）%]比较，差异有高度统计学意义（P<0.001）；住院对照组与健康对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。100例EBV感染组中有20例异淋高于10.0%，100例住院对照组中，有3例异淋高于10.0%，100例健康对照组无一例异淋高于10.0%，3组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）。在EBV感染组，有15.0%（15/100）异淋≤2.0%。结论EB病毒在体内复制水平与异性淋巴细胞的比值成高度正相关，其中也存在个体差异。荧光定量PCR检测EB病毒具有特异性强、灵敏性和准确性高的优点。

EB病毒；儿童；异型淋巴细胞；荧光定量PCR

EB病毒是疱疹病毒科r亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒，受EB病毒感染后，部分患儿因病情得不到控制，感染经久不愈，甚至继发其他恶性疾病，早期诊断并及早治疗至关重要。荧光定量PCR技术是近年来各医院确诊各种病毒感染的一种技术，直接从分子水平反应病毒在体内的复制水平，本文笔者采用荧光定量PCR分析儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性，报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集本院儿内科2011年4月～2012年3月的住院儿童患者EBV感染组和住院对照组各100例；另选100例本院儿保科健康体检儿童为健康对照组。患者中有发热、上呼吸道感染、淋巴结肿大、皮肤出血点、肝脾肿大、呕吐腹泻等各种临床表现。其中，男184例，女116例，这些患者年龄最大6岁，最小3个月。

1.2 仪器与试剂

仪器：达安公司生产的lightcycler荧光定量PCR仪；试剂：EB病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司，瑞氏染液由东耀生物科技邮箱公司（台湾）提供。

1.3 方法

所有研究对象均于入院时抽取2 mL外周静脉血EDTA抗凝，封闭送检。用实时荧光定量PCR法检测住院儿童患者血样中EB病毒 DNA，EB病毒DNA阳性患者作为EB病毒感染组，EB病毒DNA阴性患者作为住院对照组，经体检确定健康的儿童作为健康对照组。取各儿童手指末梢血1滴做血涂片，经瑞氏染色液染色后，在显微镜下进行镜检，分类计数白细胞，统计异淋比值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 平均异淋比值的比较

3组年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。EBV感染组异淋比值为（5.7±3.3）%，与住院对照组[（2.1±1.2）%]比较，差异有高度统计学意义 （P<0.001）；与健康对照组 [（1.0±0.9）%]比较，差异有高度统计学意义（P<0.001）；住院对照组与健康对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 异淋比>10.0%的比较

100例EBV感染组中有28例异淋比例高于10.0%，100例住院对照组中有3例异淋比例高于10%，100例健康对照组无一例异淋高于10%，3组比较差异有高度统计学意义（P<0.01），见表 1。

表1 平均异淋比值及异淋比 >10.0%的比较（n）

2.3 异型淋巴细胞比例和EB病毒copy数的比较

在EB病毒感染组，有15.0%（15/100）异淋≤2.0%，异淋>6.0%的共69例。而在住院对照组仅有14例异淋>6.0%，见表1。通过EB病毒感染组内比较，随着EB病毒的拷贝数的增加，异型淋巴细胞比例也显着上升。见表2。

表2 异型淋巴细胞比例和EB病毒copy数的比较（±s）

表2 异型淋巴细胞比例和EB病毒copy数的比较（±s）

异淋比 例数（n） Log EB病毒浓度（copy/mL）异淋≤2%2%＜异淋≤6%6%＜异淋≤10%异淋＞10%15 16 41 28 3.4±1.2 3.8±1.3 4.4±1.2 6.3±2.1

3 讨论

EB病毒是疱疹病毒科r亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒，广泛存在于自然界，人类普遍易感[1]。人群中病毒感染以儿童期感染最多，因此是儿科中常见的一种病毒性传染病，全身多个系统包括肝、脾、淋巴结、肾、心脏、肺、骨髓、脑等均可被感染，但以网状内皮系统病变为主。病毒感染后症状不定，病情有轻有重，可以出现典型的传染性单核细胞增多症，还可出现其它复杂的临床表现，包括病毒潜伏[2]。受EB病毒感染后，部分患儿因病情得不到控制，感染经久不愈甚至继发其他恶性疾病[3]。因此，早期诊断并及早治疗至关重要。

随着研究的不断深入，目前发现小儿外周血异型淋巴细胞升高在其他病毒感染的疾病中也会出现[4]，如在水痘－带状疱疹病毒（varicellazoster virus）、肝炎病毒（HBV）、巨细胞病毒 （cytomegalovirus）， 汉 坦 病 毒 属 （hanta virus）、 登 革 病 毒（dengue virus）等感染的患者血涂片中均发现了异型淋巴细胞[5]，说明异型淋巴细胞数量的升高对诊断EB病毒感染还缺乏特异性。长期以来，临床诊断EB病毒感染的传统方法一直由血清法占据主导地位，其检测对象是人体对病毒的免疫应答。但是儿童免疫功能尚未成熟，所以测定的抗EBV抗体很容易导致漏诊[6]。EB病毒表面抗原IgM（EB-VCA-IgM）度过窗口期1～2周后，引起人的免疫应答产生抗体，持续约1～3个月，在疾病早期检测时，阳性率较低，且此抗体在被EB病毒再次感染或免疫抑制的患者中通常不表现升高，易导致假阴性结果[7]。因此，即使用血清法检测EB病毒表面抗原IgM为阴性，也不能排除EBV感染。荧光定量PCR技术是近年来各医院确诊各种病毒感染的一种技术，直接从分子水平反应病毒在体内的复制水平。其操作方法简单，检测速率快，可批量进行临床标本检测。由于EBV在感染人体后首先在咽部上皮细胞复制，因此，用Real time-PCR法检测患者咽拭中EB病毒DNA，可以早于用血清法检测抗EB病毒抗体[8]。

综上所述，通过荧光定量PCR的检测，发现EB病毒在体内复制水平与异型淋巴细胞的比值成高度正相关，具有诊断意义，但其中也存在着个体差异。荧光定量PCR法检测EB病毒为临床诊断提供真实可靠的依据，是值得推广的一种技术手段。

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Fluorescence quantitative PCR analysis of correlation between EB virus infection and abnormal lymphocyte in children

ZHOU Jianfeng XIA Xianke CHEN Ping
The People's Hospital of Xiangtan County in Hu'nan Province,Xiangtan 411200,China

Objective To understand the ratio of abnormal lymphocyte in Peripheral blood after Epstein-Barr virus(EBV)infection in children.Methods The copies of EBV in perifheral blood were determined by Fluorescence quantitative,and were divided into three groups after the infection of PCR,including EBV-infected group,hospitalized control group and health control group,and there were 100 cases in every group.Peripheral blood was taken to smear dyeing,white blood cells classification was counted,and the ratio of abnormal lymphocyte was stated.Results The proportion of atypical lymphocytes in EBV-infected group was(5.7±3.3)%,there was significant difference between EBV-infected group and hospitalized control group of(2.1±1.2)%,and health control group(1.0±0.9)%(P<0.01)respectively.There was no significant difference between hospitalized control group and health control group(P>0.05).There were 20 cases with proportion of atypical lymphocytes above 10.0%in EBV-infected group,3 case in hospitalized control group,and no case in health control group,respectively.There was significant difference between three groups(P<0.01).And there were 15.0%(15/100)of abnormal lymphocyte which was less than or equal to EBV-infected group 2.0%.Conclusion Epstein-Barr virus replication levels in vivo have highly positive correlation with the ratio of atypical lymphocytes,in which there are individual differences.Detection of Epstein-Barr virus by fluorescence quantitative PCR has the advantages of high specificity,high sensitivity and high accuracy.

Epstein-Barr virus;Child;Atypical lymphocytes;Fluorescence quantitative PCR

R446

A

1674-4721（2012）11（a）-0097-02

2012-05-09 本文编辑：魏玉坡）