柴胡、黄芩及其配伍抗大鼠肝纤维化作用研究*

李 敏，王 斌，侯建平，杨 艳

（陕西中医学院药学院，咸阳 712046）

肝纤维化是各种致病因子累及肝脏后的一种病理状态，由各种慢性肝病引起，进一步将发展为肝癌。尽管肝纤维化的病因不同，但其病理特点基本一致：肝脏星状细胞（HSC）活化是肝纤维化形成的细胞基础，以胶原为代表的肝脏细胞外基质（ECM）代谢失衡，生成大于降解是其生化学基础。临床若能在早期采取抗纤维化措施，有可能使之停止发展或逆转[1]，对于多种慢性肝病治疗有积极意义。中药抗肝纤维化具有独特疗效，多采用舒肝理气、活血化瘀类中药，多年来实践证明中医药在抗肝纤维化中具有良好作用与发展前景[2]。

柴胡、黄芩临床常用于多种肝病的治疗，具有较好抗肝纤维化作用[3-6]。有资料表明柴胡、黄芩配伍后保肝护肝作用明显增强[7-10]，但两药配伍后如何发挥抗肝纤维化的协同作用，相关研究较少。本实验探讨柴胡、黄芩及其配伍对抗肝纤维化的作用，阐明柴胡-黄芩抗肝纤维化的关键环节及作用机制，为柴胡及黄芩防治肝纤维化提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠40只（200±5）g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（陕）2007-001。

1.2 试剂 乙醇（国产分析纯 天津市天力化学试剂有限公司）；四氯化碳（CCl4）（天津市天力化学试剂有限公司）；胆固醇(成都市精诚生化制品有限公司)；多聚甲醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乌拉坦（上海华凯科技贸易公司）。透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、层黏蛋白(LN)、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）（南京建成生物工程研究所、南京建成科技有限公司）。

1.3 药材 柴胡（伞形科多年生草本植物，北柴胡的干燥根），黄芩（唇形科多年生草本植物黄芩的干燥根）。购自百姓乐大药房，经鉴定为正品药材。柴胡、黄芩、柴胡∶黄芩（2∶1）提取工艺如下：根据药物理化性质及临床用药习惯，采取水提取工艺，具体为浸泡0.5 h，第1次加7倍量水，煎煮0.5 h，第2次给药渣中加5倍量水，煎煮0.5 h，过滤，合并滤液，浓缩为1.8 g/mL，4℃储存备用。

1.4 实验仪器 电子天平（上海天普分析仪器有限公司型号：JH1102），水浴锅（国华电器有限公司，型号：HH-2），酶标仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司，型号：DG5033A），离心机（上海安亭科学仪器厂制造，型号：TDL80-2B）；烘箱（天津汇科仪器设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 肝纤维化模型复制 采用复合因素塑造肝纤维化大鼠模型，大鼠适应性喂养3 d后，开始饮10%乙醇，饲喂高脂饲料（含玉米粉89.5%、猪油10%、胆固醇0.5%），1周后皮下注射40%四氯化碳（CCl4）橄榄油溶液5 mL/kg，以后根据大鼠体质量变化情况，每周2次（周三、周六）皮下注射40%CCl4溶液3 mL/kg，连续 3 周。

2.2 分组给药 大鼠按体质量编号后采用随机数字表法随机分为5组：即正常对照组、肝纤维化模型组、柴胡水煎液组（18 g/kg）、黄芩水煎液组（18 g/kg）、柴胡-黄芩合煎液组（18g/kg）。模型建立后，柴胡水煎液组、黄芩水煎液组、柴胡-黄芩（2∶1）合煎液组灌胃给药10 mL/kg，模型组及正常对照组灌胃等量蒸馏水，每日1次，连续7 d。

2.3 HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C测定 第7天晚禁食不禁水12 h，次日腹腔注射乌拉坦（1.0 g/kg）麻醉，腹主静脉取血，分离血清。按试剂盒说明书操作，用酶联免疫吸附法（Elisa法）测定血清中HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C含量。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

2.4 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

实验结果显示，模型组大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C比正常对照组明显升高。柴胡-黄芩（2∶1）能降低肝纤维化大鼠血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量值，与模型组比较有统计学意义（P<0.05）；柴胡、黄芩及柴胡-黄芩（2∶1）均能降低血清LN，其中柴胡、黄芩作用显著（P<0.05），柴胡-黄芩（2∶1）作用非常显著（P<0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C的含量（±s，n=8）Tab.1 Content of serum HA,PCⅢ,LN andⅣ-C in each group(±s，n=8)

表1 各组大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C的含量（±s，n=8）Tab.1 Content of serum HA,PCⅢ,LN andⅣ-C in each group(±s，n=8)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别 剂量（g/kg）PCⅢ Ⅳ-C HA LN正常对照组 - 8.85±2.79**22.55±5.84*153.25± 6.85**34.50±2.96**模型组 - 16.82±4.2129.63±6.03227.86±18.7450.57±6.64柴胡组 1812.50±2.6427.33±2.46179.87±10.1740.76±5.70*黄芩组 1813.45±1.7828.44±7.91189.61±11.3443.49±3.81*柴胡-黄芩组 12+610.50±2.64* 26.36±2.92*154.31± 9.47* 39.12±6.39**

4 讨论

大多数肝硬化都是由肝纤维化的各种慢性肝病发展引起，因此能在肝纤维化早期进行抑制或逆转，对于各种慢性肝病有积极治疗意义。

参与肝纤维化形成的细胞外基质成分包括胶原蛋白、蛋白多糖和非胶原性蛋白。HA是构成蛋白多糖的主要成分，肝脏受损时，HSC合成的HA会明显增加，而内皮细胞受损使血液中的HA摄取和降解减少，因而血液中HA水平升高。Ⅲ型前胶原反映肝内Ⅲ型胶原合成，血清PCⅢ含量增高与肝细胞炎性反应和坏死导致肝内Ⅲ型胶原裂解增加有关，直接反映Ⅲ型胶原的代谢状况。LN大量沉积可引起肝窦毛细血管化，其血清值是反映基底膜更新率的指标，可反映肝窦的毛细血管化和汇管区纤维化。Ⅳ－C是基底膜的主要成分，反映基底膜胶原的更新率，与肝纤维化程度呈正相关。因此肝纤维化时HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量变化最明显，是反映肝纤维化最敏感的指标[11]。

柴胡、黄芩是临床常用的抗肝纤维化中药，对其相关机制有一定深入的研究，柴胡是通过抑制肝炎和肝星状细胞活化，其中深层机制可能与上调过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ）表达有关[3-4]。黄芩抗肝纤维化作用，包括减少肝脏羟脯氨酸含量，降低肝区平滑肌细胞α-肌动蛋白阳性表达，激活caspase-3，caspase-9，促进ERK-P53的途径，导致最终HSC-T6细胞凋亡，降低血清酶学异常，能改善肝纤维化病理形态等[5-6]。两者配伍显示出增强的保肝作用，其中以柴胡-黄芩（2∶1）效果为佳[7]，故本实验柴胡-黄芩（2∶1）配伍探讨其抗肝纤维化效应。

复合因素（包括高脂饲料、乙醇和CCl4）的给与是一种快速可靠复制肝纤维化模型的方法[12]，因此作为实验造模方法。实验结果显示，模型组大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C比正常对照组明显升高。柴胡-黄芩（2∶1）能降低肝纤维化大鼠血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C 的含量值（P<0.05）；柴胡、黄芩及柴胡-黄芩（2∶1）均能降低血清 LN，其中柴胡、黄芩作用显著（P<0.05），柴胡-黄芩（2∶1）作用非常显著（P<0.01）。

本实验结果表明，柴胡-黄芩（2∶1）配伍治疗肝纤维化比柴胡、黄芩单味中药效果更明显。其作用机制可能与配伍药物相互之间体内代谢动力学影响有关。针对这些方面，有必要进一步结合药代动力学研究，探讨肝纤维化状态下的药物配伍后代谢行为对药效影响。

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