HPLC法同时测定七叶灵颗粒中特女贞苷与柚皮苷的含量Δ

顾嘉钦，朱珺（上海交通大学附属胸科医院药剂科，上海200030）

HPLC法同时测定七叶灵颗粒中特女贞苷与柚皮苷的含量Δ

顾嘉钦＊，朱珺#（上海交通大学附属胸科医院药剂科，上海200030）

目的：建立同时测定七叶灵颗粒中特女贞苷与柚皮苷含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V），检测波长为224nm，流速为1mL·min－1，柱温为30℃。结果：特女贞苷与柚皮苷的进样量分别在0.04～1.00、0.08～2.00μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r均为0.9999）；平均加样回收率分别为101.17%和100.32%，RSD分别为2.10%和2.17%（n均为6）。结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于七叶灵颗粒中特女贞苷与柚皮苷的含量测定。

高效液相色谱法；七叶灵颗粒；特女贞苷；柚皮苷；含量测定

肺癌是近50年增长最快的恶性肿瘤之一，居我国癌症发病率、死亡率之首[1]。七叶灵颗粒是我院自行研制的复方中药制剂，由生黄芪、黄精、女贞子、天花粉、灵芝、石见穿、七叶一枝花、山慈菇、骨碎补、陈皮10味药材组成。该药是我院根据中医扶正祛邪、调节阴阳平衡理论，总结30多年临床肿瘤治疗经验，在中医辩证论治基础上自行研制的抗肿瘤药物，也是目前为数不多的治疗肺癌的特色医院制剂。经多年来的实验研究和临床应用证实，七叶灵颗粒不仅有抑瘤作用，同时还能减轻化疗副作用，增加肿瘤细胞凋亡数，升高白细胞，提高晚期肺癌患者的生存率、近期疗效及生存质量，并延长其中位生存期[2～4]。中药制剂现代化的关键在于质量控制和质量标准现代化[5]，因此笔者采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定七叶灵颗粒中有效成分特女贞苷与柚皮苷的含量，为七叶灵颗粒提供一种质量控制方法。

1 仪器与试药

LC-10Ai系列HPLC仪，配有SPD-20A紫外检测器、SIL-10Ai自动进样器、CTO-20AC柱温箱、CBM-20A系统控制器（日本岛津公司）。

特女贞苷（纯度：92.1%）、柚皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为111926-201102、110722-200610）；七叶灵颗粒（上海交通大学附属胸科医院研制，上海市蔡同德堂中药制药厂代加工，批号：20100901、20110101、20110701、20111101）；甲醇、乙腈均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V）；检测波长：224nm；流速：1mL·min－1；柱温：30℃；进样量：20μL。理论板数按特女贞苷峰计算应不小于4000。在该色谱条件下，特女贞苷峰与柚皮苷峰分离良好，且与其他杂质峰也分离良好。

2.2 对照品溶液的制备

取特女贞苷对照品14.1mg（含量测定以92.1%计），精密称定，置于50mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.2597mg·mL－1的特女贞苷对照品溶液。于2～8℃低温保存，备用。

取柚皮苷对照品8.1mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.81mg·mL－1的柚皮苷对照品溶液。于2～8℃低温保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取七叶灵颗粒10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，称重，加热回流1h，放冷，再称重，用50%乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方配比取各味药（缺女贞子、骨碎补、陈皮），根据七叶灵颗粒制备工艺制成阴性样品，再按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备 取“2.2”项下2种对照品溶液，分别用甲醇稀释制成浓度为20μg·mL－1的特女贞苷对照品溶液和40μg·mL－1的柚皮苷对照品溶液，分别吸取2、5、10、20、30、50μL进样，测定峰面积。以浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得特女贞苷、柚皮苷的回归方程分别 为 Y＝2.65×104X+842（r＝0.9999，n＝6）、Y＝7.16×104X+8497（r＝0.9999，n＝6）。结果表明，特女贞苷、柚皮苷的进样量分别在0.04～1.00、0.08～2.00μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5.2 精密度试验 精密吸取浓度为20μg·mL－1的特女贞苷对照品溶液和40μg·mL－1的柚皮苷对照品溶液各20μL，在上述色谱条件下连续进样5次，测定峰面积。结果，特女贞苷和柚皮苷峰面积的RSD分别为2.28%和1.97%（n均为5），表明仪器精密度良好。

2.5.3 特女贞苷峰与柚皮苷峰的鉴别试验 经多次调整流动相种类和配比，在流动相为乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V）时，七叶灵颗粒样品中特女贞苷峰与柚皮苷峰分离良好，通过液相色谱-质谱（LC-MS）检测可证明该峰为特女贞苷峰与柚皮苷峰，详见图1、图2。

2.5.4 空白干扰试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，在上述色谱条件下进样测定。结果发现，特女贞苷峰与柚皮苷峰处阴性对照无干扰。色谱见图3。

图1 特女贞苷的MS图A.ESI（+）模式下的特女贞苷对照品（m/z 686.6，35.1min峰）；B.ESI（－）模式下的特女贞苷对照品（m/z 686.6，35.1min峰）；C.ESI（+）模式下的供试品（35.2min峰）；D.ES（I－）模式下的供试品（35.2min峰）Fig 1MS chromatograms of specnuezhenideA.specnuezhenide control under ESI（+）mode（m/z 686.6，35.1min）；B.specnuezhenide control under ESI（－）mode（m/z 686.6，35.1min）；C.test sample under ESI（+）mode（35.2min）；D.test sample under ESI（－）mode（35.2min）

图2 柚皮苷的MS图A.ESI（+）模式下的柚皮苷对照品；B.ESI（－）模式下的柚皮苷对照品；C.ESI（+）模式下的供试品（40.53min峰）；D.ESI（－）模式下的供试品（40.53min峰）Fig 2MS chromatograms of naringinA.naringin control under ESI（+）mode；B.naringin control under ESI（－）mode；C.test sample under ESI（+）mode（40.53min）；D.test sample under ESI（－）mode（40.53min）

图3 高效液相色谱图A.混合对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.特女贞苷；2.柚皮苷Fig 3 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.negative control；C.test sample；1.specnuezhenide；2.naringin

2.5.5 稳定性试验 取同一供试品溶液20μL，分别于0、1、2、3、4、5d时进样，测定峰面积。结果，特女贞苷和柚皮苷峰面积的RSD分别为3.01%和2.14%（n均为6），表明供试品溶液在5d内稳定性良好。

2.5.6 重复性试验 取同一批七叶灵颗粒，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样20μL，测定样品含量。结果，样品中特女贞苷的含量为（85.36±3.73）μg·g－1，RSD＝4.37%（n＝6）；柚皮苷的含量为（159.67±27.42）μg·g－1，RSD＝1.72%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.5.7 加样回收率试验 取已知含量的同一批（批号：20111101）样品6份，每份5g，精密称定，分别加入特女贞苷对照品约0.5mg和柚皮苷对照品约1mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，各取20μL进样，在上述色谱条件下测定峰面积，计算加样回收率，结果分别见表1和表2。

表1 特女贞苷的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test of specnuezhenide（n＝6）

表2 柚皮苷的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2Results of recovery test of naringin（n＝6）

2.6 样品含量测定

取4批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述方法操作，取20μL进样测定，计算样品中特女贞苷和柚皮苷的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝4）Tab 3Results of content determination of samples（n＝4）

从4批样品含量测定结果来看，七叶灵颗粒含特女贞苷与柚皮苷量稳定，可应用于质量标准。

3 讨论

女贞子是一味常用的扶正固本药，具有抗炎抑菌、升高白细胞、促进免疫等作用[6]，《中国药典》[7]中其主要检测成分为特女贞苷，且专属性强。骨碎补也是一味常用中药，现代药理及临床研究表明，骨碎补具有良好的促进骨折愈合、抗骨质疏松、抗炎、促进牙齿生长、防治中毒性耳聋、降血脂等活性[8]，《中国药典》[7]中其主要检测成分为柚皮苷；文献报道陈皮中也含有柚皮苷[9]，因此在空白试验中去除了这3味药材。

由于七叶灵颗粒由10味药材组成，成分复杂，为能同时检测特女贞苷与柚皮苷，笔者参考了《中国药典》[7]及文献[10]方法，以甲醇-水作为展开剂，特女贞苷出峰好，但柚皮苷出峰不尖锐；通过不断探索和调整，使用乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V）为展开剂，可避开前后杂质干扰，且特女贞苷与柚皮苷出峰尖锐、分离度好、理论板数高。由于前后均有杂质峰，因此梯度洗脱受到限制，故未采用梯度洗脱方法，而是通过空白对照试验和借助LC-MS鉴别出特女贞苷峰与柚皮苷峰。

七叶灵颗粒制作工艺采用的是水提法，因此为避免损失，在参考《中国药典》[7]及文献[10]方法的基础上，本试验对比了超声法与回流法的提取效果，结果相同时间内特女贞苷的提取回收率回流法大于超声法，因此采用回流法提取。试验还对乙醇和甲醇进行了回流对比试验，发现乙醇回流较甲醇回流的特女贞苷提取回收率更高，柚皮苷则差异不大，因此选择乙醇回流法。通过不同浓度乙醇回流试验，发现低浓度乙醇（30%）较高浓度乙醇（70%）回流的特女贞苷提取回收率高，而柚皮苷基本相同，但低浓度乙醇回流杂质多，且不宜滤过，故最终确定采用50%乙醇进行回流试验。本试验还比较了不同时间回流对结果的影响，发现回流1、2、4h的结果差异不大，这可能与颗粒剂原本就是水提物质与糊精，回流1h足以将特女贞苷与柚皮苷溶于溶媒内有关，因此选择使用50%乙醇回流1h的提取方法，该方法操作简单、结果稳定。

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[3] 金长娟，沙慧芳，赵兰香，等.七叶灵方诱导裸鼠人肺腺癌A549移植瘤细胞凋亡的实验研究[J].中西医结合学报，2004，2（4）：285.

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[5] 文世伟，黄跃洲，许 静.试论中药制剂现代化的关键问题及策略[J].中国药房，2008，19（27）：2157.

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Content Determination of Specnuezhenide and Naringin in Qiyelin Granules by HPLC

GU Jia-qin，ZHU Jun（Dept.of Pharmacy，Shanghai Chest Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200030，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of specnuezhenide and naringin in Qiyelin granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of acetonitrile-4%acetic acid（17∶83，V/V）at flow rate of 1mL·min－1.The detection wavelength was 224nm，and the column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range was 0.04～1.00μg for specnuezhenide（r＝0.9999）and 0.08～2.00μg for naringin（r＝0.9999）with average recovery of 101.17%（RSD＝2.10%，n＝7）and 100.32%（RSD＝2.17%，n＝6），respectively.CONCLUSION：The method is simple，accurate and reproducible.It can be used for the content determination of specnuezhenide and naringin in Qiyelin granules.

HPLC；Qiyelin granules；Specnuezhenide；Naringin；Content determination

R283.625；R927.2

A

1001-0408（2012）43-4086-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.21

2012-07-17

2012-09-10）