中药药物抗兔大肠杆菌的筛选

马利芹

（河北北方学院动物科技学院，河北 张家口075131）

兔大肠杆菌病又称粘液性肠炎，是由致病性大肠杆菌及其毒素引起的一种暴发性仔兔肠道传染病，以水样或胶冻样粪便和脱水为特征，并可引发急性败血症和肺炎[1]。这种病一年四季均可发生，冬春季多发，主要见于1～4月龄的幼兔，尤以断奶前后的仔兔发病率和死亡率高，可达80%以上。近年来，随着养兔业的发展，该病己成为危害养兔业的主要传染病之一，给养兔业带来严重的经济损失[2]。由于该病常与兔瘟混合感染，并且易与其他腹泻性疾病混淆，临床上很难防治，目前常以抗生素治疗为主，但其对抗生素的多重耐药性导致治疗上的困难，而中药在抗菌方面具有独特的优势，本研究拟从常用中药中筛选抗兔大肠杆菌病的有效中药，有利于临床进一步研制治疗兔大肠杆菌病感染的中药制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验分别选取黄连、黄芩、白头翁、柴胡和金银花为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 将所购中药在80℃干燥2h后分别称取100g，加入蒸馏水至水面略高出，放入4℃冰箱中浸泡24h，加热至沸，再以文火煎30min，用纱布过滤，保留滤液，再加入相同剂量的水，文火煎30min，过滤后合并两次滤液，加热浓缩至100ml，1 500r·min－1离心15min，取上清液无菌过滤后备用。每1mL浓缩液约为生药1g。

1.2.2 菌种 兔源致病性大肠杆菌（rEPEC）菌种3株（临床分离菌株），血清型分别为O115、O119、O21，CVCC249标准大肠埃希菌菌株（国家兽医微生物菌种管理保存中心标准株）。

1.2.3 置放菌种 用灭菌棉签拭子将大肠杆菌的肉汤纯培养物（培养24h）均匀涂布在麦康凯平板上，用灭菌金属打孔器打孔，孔径6mm，每孔加入药液0.05ml，设生理盐水对照，置于37℃培养24～48h，用游标卡尺测量抑菌圈大小，判断各种药液对大肠杆菌的抑菌效果。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定 按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的液体稀释法测定所筛选中药对实验菌株的MIC[3]。应用2倍稀释法对药物稀释，稀释液为60℃无菌MH培养基，迅速振荡混匀，各试管中中药的浓度分别稀释到0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 13g·mL－1。然后，在每个试管中加入0.5麦氏比浊单位的rEPEC 10μL，试验设空白对照，37℃培养24h分别转种麦康凯平板培养基，24h后无细菌生长的试管则为药物的MIC。标准大肠埃希菌CVCC249菌株作为本试验的质控菌株。

1.2.5 协同抗菌 本试验采用微量液体平板棋盘法。每种中药最高浓度为其MIC的2倍，倍比稀释到其MIC的1/16，分别沿无菌微孔板横轴、纵轴加不同浓度的两种药物的 MH培养基50μL，再将1.5×105CFU·mL－1菌液100μL加入孔中，同时设不加菌的阴性对照和不加任何抑菌剂的菌液作为阳性对照。37℃培养24h观察结果。记录单独应用两药的MIC，并选择最佳组合效应时两药联合应用时各自的MIC，以计算FIC指数。FIC指数≤0.5为协同作用，＞0.5～1为相加作用，＞1～2为无关作用，＞2为拮抗作用[4，5]。

2 结 果

2.1 抗rEPEC中药筛选结果

结果显示，5种中药液周围出现抑菌圈，黄连、黄芩、白头翁、金银花和柴胡抑菌效果良好，生理盐水周围未见抑菌圈。

2.2 抗rEPEC中药MIC测定结果

黄连、黄芩、白头翁、柴胡和金银花对rEPEC菌种的MIC见表2。黄连MIC最小，其次黄芩和白头翁MIC小于柴胡和金银花。空白对照各管转到普通麦康凯培养基后均可见细菌生长。

表1 试验用中草药的体外抑菌效果

表2 5种中药对rEPEC的最小抑菌浓度结果

2.3 抗rEPEC中药协同抗菌试验结果

黄连、黄芩、白头翁、柴胡和金银花两两联合应用的FIC指数分布见表3，其中黄连和白头翁、黄芩和白头翁联合应用时FIC主要分布＜0.5，主要以协同作用为主；黄连和黄芩、黄连和金银花、黄芩和金银花以及白头翁和金银花联合应用时FIC主要分布0.5～1，主要为相加作用；黄连和柴胡、黄芩和柴胡、白头翁和柴胡以及柴胡和金银花联合应用时FIC主要分布1～2，主要为无关作用。

表3 5种中药两两联合应用对rEPEC的FIC分布结果

3 讨 论

研究表明，细菌一般不对抗菌中药产生耐药性，中药在预防和控制细菌感染性疾病方面发挥着积极作用。中药抗菌可以通过改变细胞膜和离子通道通透性、抑制菌体产生能量、抑制菌体内酶活性、增强中性粒细胞吞噬能力，减少细菌内毒素产生、抑制蛋白质合成、抑制细菌生物被膜形成等机制，从而发挥抗菌作用。此外，中药通过消除R质粒、抑制细菌主动外排泵、抑制β－内酰胺酶、抑制耐药基因表达等途径逆转细菌耐药性[6]。中药除了直接抗菌作用外，还具有增强机体免疫功能的作用。另外，中药来源广泛，价格低廉。因此，研究和利用中药对解决目前普遍存在的耐药菌株的产生和广泛关注的抗生素残留问题具有重要意义。

本试验所采用的黄连抗菌谱广泛，极低浓度即开始阻止大肠杆菌生长[7]。黄芩也具有广谱抗菌作用，体外试验对多种革兰染色阳性菌、阴性菌、螺旋菌及真菌均有抑制作用，黄酮类活性物质是其有效成分。国内学者在利用中药对产β－内酰胺酶的大肠埃希菌抗菌效果研究中认为黄芩抑菌效果最好[8，9]。白头翁鲜汁、煎剂、乙醇提取物均有明显的抗菌作用，其主要抗菌成分是原白头翁素和白头翁素[10，11]。研究表明，金银花水浸剂具有较好抗菌效果，其抗菌消炎的主要化学成分是绿原酸及异绿原酸[12]。此外，柴胡也具有消炎作用。本试验结果表明黄连、黄芩和白头翁MIC值较小，可有效抑制rEPEC生长，且黄连和白头翁联合、黄芩和白头翁联合应用时FIC值主要分布＜0.5，具有相互协同作用。

体外抑菌试验简单方便，可以比较直观了解中药的抑菌能力。因此，在开发中药抗菌药物开发前期适用于高通量筛选有效药物或筛选敏感菌株，但是体外实验并不能取代体内抗菌实验。本试验表明黄连、黄芩和白头翁具有良好的抑制rEPEC效果，且具有相互协同作用，这一结果为开发抗rEPEC的中药提供了有益参考。

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