低速离心法测定大黄酚脂质体包封率
2012-11-28王永利王立华夏明华赵子兵张丹参
王永利，王立华，夏明华，赵子兵，张丹参
（1.河北北方学院理学院，河北 张家口075000；2.北京工业大学环境与能源工程学院，北京100124；3.河北北方学院药学系，河北 张家口075000）
大黄酚 （chrysophanol，Chry）化学名称1，8－二羟基－3－甲基蒽醌 （1，8－dihydroxy－3－methylanthraquinone），具有较明显止咳的作用，对甲型链球菌、肺炎球菌、流感杆菌及卡他球菌有不同程度的抑制作用，并能促使神经兴奋和肌肉麻痹。但大黄酚在水中溶解度差，生物利用度低，给药效果不好。脂质体是一种将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状药物载体制剂。研究表明，将药物包裹于脂质体内，不仅可以增加药物的水溶性，而且可以提高药物在体内的靶向性。
脂质体的包封率是指被包裹物质 （如某药物）在脂质体悬液中占投药总量的百分含量。包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标之一，也是脂质体的优势所在。测定脂质体包封率的方法有很多，如葡聚糖凝胶柱层析法、超速离心法、透析法等[1－3]，但不是每一种方法都适合所有的脂质体，故在考察脂质体包封率时，只有通过理论和试验选择合适的测定方法，测出的包封率才更有意义。本文通过各种脂质体分离方法考察基础上，采用低速离心方法测定大黄酚脂质体包封率进行了探究。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
U－3900型紫外－双波长分光光度计 （日立，日本）；800型离心沉淀器 （上海手术器械厂）；752N型紫外分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）；CX－250超声波清洗器 （北京医疗设备工厂）；旋转蒸发器RE52－99（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵 （巩义市予华仪器有限责任公司）；FA2004B型电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）；HPB－3型pH酸度计 （上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试剂
大黄酚对照品 （中国药品生物制品检定所，批号：110796－200716）；Tris（北京鼎国生物技术有限责任公司）；胆固醇 （批号76C10150，北京鼎国生物技术有限责任公司）；PEG2000（北京鼎国生物技术有限责任公司）；卵磷脂 （批号20100509，北京华清美恒天然产物技术开发有限公司）；维生素E （北京鼎国生物技术有限责任公司）；甲醇 （色谱纯，天津市永大化学试剂开发中心）；盐酸、无水乙醇等均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 大黄酚脂质体的制备[4]
分别准确称取0.0030g大黄酚、0.0300g卵磷脂、0.0100g胆固醇、0.0100g维生素E、0.0100g PEG－2000，并在适量乙醇中溶解，水浴条件下减压将有机溶剂蒸出，使脂质体均匀成膜。再抽真空半小时除尽有机溶剂，加入一定量pH8.2的Tris缓冲溶液充分水化，40℃水浴振荡水化2h使膜脱落，冰水浴中超声至均一体系，既得大黄酚脂质体混悬液。
2.2 脂质体中大黄酚总量的测定[5]
精密移取大黄酚脂质体1.00mL，用甲醇溶解并定容至10mL，3份，在428nm处测其吸光度A，计算的脂质体悬浊液中大黄酚总质量浓度C＝0.289mg·mL－1，RSD＝0.21% （n＝9）。按投药量计算的质量浓度为0.300mg·mL－1，得率为0.963。
2.3 低速离心法的建立
2.3.1 离心强度的选择
精密称取大黄酚3mg，用空白脂质体溶液定容至25mL，超声混匀，备用。分别精密移取大黄酚游离药与空白脂质体混合液3mL于6支离心管，分别在500r·min－1、1 000r·min－1、1 500r·min－1、2 000r·min－1、2 500r·min－1、3 000r·min－1转速下离心4min，倒掉上清液，用移液管移取5mL甲醇于离心管，振荡溶解沉淀，在428nm处测吸光度，根据标准曲线计算大黄酚含量分别为：0.28mg、0.33mg、0.32mg、0.32mg、0.33mg、0.34mg，相应的分离度为：0.78、0.92、0.89、0.89、0.89、0.92、0.94。实验结果显示在离心时间为4min时，转速超过1 000r·min－1，分离效果变化不再明显，故选择离心强度为1 000r·min－1。
表1 离心强度的选择
2.3.2 离心时间的选择
分别精密移取大黄酚游离药与空白脂质体混合液3mL于6支离心管，固定转速为1 000r·min－1转速，分别离心30s、60s、90s、120s、150s、180s，倒掉上清液，用移液管移取5mL甲醇于离心管，振荡溶解沉淀，在428nm处测吸光度，根据标准曲线计算大黄酚含量分别为：0.26mg、0.30mg、0.32mg、0.33mg、0.33mg、0.33mg，相应的离心度为：0.72、0.83、0.89、0.92、0.92、0.92。结果表明在转速为1 000r·min－1、离心时间120s时，基本达到离心平衡，不再有沉淀析出，故选离心时间为120s。
表2 离心时间的选择
2.3.3 间歇性离心与连续性离心对比
分别精密移取大黄酚游离药与空白脂质体混合液3mL于2支离心管中，分别在1 000r·min－1，离心120s无间歇、间歇2次、间歇4次、间歇6次、间歇8次，倒掉上清液，用移液管移取5mL甲醇分别于5支离心管，振荡溶解沉淀，在428nm处测吸光度，根据标准曲线计算大黄酚含量分别为：0.33mg、0.33mg、0.33mg、0.34mg、0.34mg，相应的分离度为：0.92、0.92、0.92、0.94、0.94。实验结果显示1 000r·min－1，离心时间为120s时间歇6次时效果最佳。
表3 间隙次数的选择
2.3.4 低速离心法对游离药物和脂质体的分离作用考察
精密称取大黄酚1mg，精密移取空白脂质体溶液2mL，超声使其混合均匀后在1 000r·min－1，20 s／次的条件下离心6次。将上清液取出，用甲醇将沉淀溶解，在428nm处测定其吸光度，计算沉积的大黄酚的质量。平行操作三次，计算得沉淀的药物量分别为投药量的101.00%，99.39%，97.28%，说明该离心条件能使脂质体中的游离的药物完全沉淀。
2.4 大黄酚包封率的测定[6]
将制得的大黄酚脂质体全部转移至10mL容量瓶中，用pH8.2的Tris缓冲溶液定容，混合均匀。精密量取2.00mL于离心管中，在离心机上以1 000r·min－1，20s／次的条件下离心6次，弃去上层清液.精密移取5.00mL甲醇溶解沉淀，以甲醇做参比测定吸光度A，测定2.0mL中游离大黄酚的含量。用以下公式计算包封率。
式中：W总为大黄酚总量；W游离为游离大黄酚的含量。
结果重复三次测得按上次方法值得脂质体的包封率分别为94.89%，93.91%和93.46%。
3 分析与讨论
包封率是评价脂质体制备工艺的主要指标，同时在对脂质体制剂稳定性及药物释放动力学研究中也常常需要测定脂质体的实时包封率[7]。常用的包封率测定方法有凝胶色谱法、透析法、超速离心法、超滤膜过滤法等。凝胶色谱法是利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离，由于游离的脂溶性药物不能被水性洗脱液从凝胶柱上洗脱下来，故无法计算该方法的回收率。透析法需要知道脂质体的大致粒径范围，且需要大量的透析介质。超速离心法是根据脂质体与游离药物在液体介质中沉降速度不同进行分离的，在超速条件下脂质体和脂溶性游离药会共同沉降，而无法实现分离，因此，不适合用于脂溶性药物包封率的测定。超滤法是利用超滤膜的孔径不同来实现对脂质体悬混液的物理筛分，但存在回收率小于90%的问题。鉴于上述方法的缺陷，建立一种简单、可信、适用于测定脂溶性药物包封率的方法十分必要。
本实验采用低速离心法分离脂质体和未包裹的药物，具有操作简便，仪器要求低等优点。这种方法应用的前提是药物在水性介质中的溶解度很小 （小于投药量的5%），该法应用的关键是离心强度和离心时间的正确选择。离心强度过小药物沉淀不完全，离心强度过大则含药脂质体被沉淀。
4 结 论
本实验采用低速离心法分离大黄酚脂质体和未包裹的游离药物，具有操作方法简便，对设备的要求低等优点。因为脂溶性药物在水相中不溶解并且有聚集成小颗粒易沉降的特性，在测定脂溶性药物包封率的时候采用低速离心法是比较合适的。该方法的关键是离心速度与离心时间的正确选择。离心速度大，时间长会使脂质体沉降；离心速度小，时间短会使游离药物沉降不完全。通过大量的预实验，最终确定在1 000r·min－1、20s／次的条件下离心6次可以使游离药物几乎全部沉淀且很少引起脂质体的沉降。采用此方法测定的大黄酚脂质体的包封率稳定可靠，证明低速离心法是测定脂溶性药物脂质体包封率的有效方法。
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[5]王永利，张明媚，李维爽，等.大黄酚脂质体的制备工艺研究 [J].中国新药杂志，2011，20（09）：825－832.
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