FHIT基因在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

张春霆 刘冉录 林英立 徐 勇

膀胱癌是最常见的泌尿系肿瘤，其中移行细胞癌（transitional cell carcinoma，TCC）占90%。膀胱癌的发生、发展可能是一种牵涉到多种抑癌基因的失活和致癌基因激活的复杂过程。本文旨在研究脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad，FHIT）基因与膀胱移行细胞癌之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年9月—2011年3月我院泌尿外科预存组织新鲜标本，病理证实为膀胱移行细胞癌62例，其中男46例，女16例，年龄29～78岁，平均（56.5±7.5）岁。肿瘤分期按UICC-TNM标准，分为表浅性肿瘤（Tis～T1组）39例，浸润性肿瘤（T2～T4组）23例。病理分级按WHO方案：Ⅰ级37例，Ⅱ～Ⅲ级25例。同时获取部分患者癌旁正常膀胱组织35例。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 采用UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒（MBI产品，购自上海生物工程技术服务有限公司）。

1.2.2 FHIT基因引物 检索基因库查询FHIT基因的cDNA序列（U20770），用Primer 6引物设计软件设计引物序列如下：上游5′-TGA GGA CAT GTC GTT CAG ATT G-3′，下游5′-GTG TCA CTG AAA GTA GAC C-3′，引物扩增片段462 bp（合成于日本TaKaRa宝生物工程大连有限公司）。β-actin引物（合成于北京大学医学部分子生物学实验室），上游5′-GAA TTC ATG TTT GAG ACC TTC AA-3′，下 游 5′-CC GGA TCC ATC TCT TGC TCG AAG TCC A-3′，扩增片段326 bp。DNA Marker为PRB322DNA/AIU1Marke（rMBI产品，购自上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.2.3 cDNA合成 按MMLV第1链cDNA合成试剂盒说明进行。PCR扩增：PCR反应体系配制前，将FHIT基因引物配制成100 μmol/L的溶液，工作液再稀释4倍。加入β-actin上下游引物溶液作为内参照采用同管扩增，0.5 mL PCR薄壁管加入以下成分：ddH2O 14.8 μL；10×buffer 3 μL；dNTP 3 μL；MgCl21.8 μL；cDNA 5 μL；FHIT上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL；β-actin上下游引物各0.5 μL，反应体系终体积为30 μL，放入PCR仪中反应，条件如下：94 ℃ 30 s，57 ℃40 s，72℃ 30 s，共30个循环后，72℃延伸5 min，补平PCR产物的延伸末端进行PCR反应，完毕后，取反应产物8 μL加入溴芬兰2 μL，在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，电压5 V/cm。电泳结果在凝胶成像系统中应用Gene Tools及Gene Snaps软件系统照相可见正常组织电泳带FHIT基因表达扩增产物大小为462 bp，β-actin扩增片段大小为362 bp，见图1。

Figure 1 Electrophoresis of PCR-amplified FHIT gene expression in normal tissues图1 正常组织中FHIT基因表达扩增电泳

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，样本率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

膀胱移行细胞癌中的FHIT基因缺失表达率高于正常膀胱组织，Ⅱ～Ⅲ级的FHIT基因缺失表达率高于Ⅰ级，T2～T4期的FHIT基因缺失表达率高于Tis～T1期，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。

Table 1 Expression of FHIT gene between normal bladder tissue and transitional cell bladder carcinoma表1 正常膀胱组织和膀胱移行细胞癌中FHIT基因的表达情况 例（%）

3 讨论

FHIT基因是肿瘤抑制基因，包含了脆性位点FRA3B68，该脆性位点部位与染色体重排过程中断裂位点关系密切，研究显示在所有与肿瘤相关的染色体转位中，超过52%的转位断裂位点与脆性区域相关[1]。FHIT基因定位于染色体3P 14.2。Ohta等[2]利用定位克隆技术及外显子捕获法发现该基因由10个外显子组成，其中5～9个编码外显子，其蛋白质结构与三价组氨酸域HIT蛋白高度同源（>50%），该基因跨越人类染色体脆性位点FRA3B。FHIT基因存在于多种正常组织中，但其异常表达与胃癌[3]、喉癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]及小细胞肺癌[7-8]有关。

本研究结果显示FHIT基因在癌旁正常膀胱组织中缺失率（2.86%）低于在膀胱移行细胞癌组织（58.06%），表明FHIT基因异常表达与膀胱移行细胞癌发生有关，FHIT基因异常在膀胱移行细胞癌中可能是一频发事件；在膀胱移行细胞癌中，随着病理分期及临床分期的进展，FHIT表达率下降，表明FHIT基因的丧失表达可能参与了膀胱癌的发展，这一结果与大多研究FHIT基因在肿瘤中的表达状况类似。

Abraham等[9]对膀胱癌的染色体检测发现，FHIT基因异常促进了膀胱癌的进展。Baffa等[10]利用RT-PCR对6例膀胱癌起源的细胞和3例原发性膀胱癌的FHIT基因转录本的完整性进行检查，发现6个细胞株中有3个（50%）无野生型FHIT转录表达；4个细胞株中未测到Fhit蛋白，表明FHIT基因异常与膀胱癌发生有关。

FHIT基因作为一个新的肿瘤抑制基因，异常表达于多种肿瘤组织来源的细胞系中，若要了解FHIT基因在膀胱移行细胞癌中抑制肿瘤作用的分子机制，尚需进一步深入研究。

[1]Burrow AA,Williams LE,Pierce LC,et al.Over half of breakpoints in gene pairs involved in cancer-specific recurrent translocations are mapped to human chromosomal fragile sites[J].BMC Genomics,2009，10(1):59.

[2]Ohta M,Inoue H,Cotticelli MG,et al.The FHIT gene,spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)breakpoint,is abnormal in digestive tract cancers[J].Cell,1996，84(9):587-597.

[3]Czyzewska J,Guzińska-Ustymowicz K,Pryczynicz A,et al.Immunohistochemical assessment of Fhit protein expression in advanced gastric carcinomas in correlation with Helicobacter pylori infection and survival time[J].Folia Histochem Cytobiol，2009，47(1):47-53.

[4]Paluszczak J,Misiak P,Wierzbicka M,et al.Frequent hypermethylation of DAPK,RARbeta,MGMT,RASSF1A and FHIT in laryngeal squamous cell carcinomas and adjacent normal mucosa[J].Oral Oncol，2011，47(2):104-107.

[5]Sun J,Liu J,Pan X,et al.Effect of zinc supplementation on N-nitrosomethylbenzylamine-induced forestomach tumor development and progression in tumor suppressor-deficient mouse strains[J].Carcinogenesis，2011，32(3):351-358.

[6]Syeed N,Husain SA,Sameer AS,et al.Mutational and promoter hypermethylation status of FHIT gene in breast cancer patients of Kashmir[J].Mutat Res，2011，707(12):1-8.

[7]Jiang F,Todd NW,Li R,et al.A panel of sputum-based genomic marker for early detection of lung cancer[J].Cancer Prev Res(Phila)，2010，3(12):1571-1578.

[8]Bhutani M,Pathak AK,Fan YH,et al.Oral epithelium as a surrogate tissue for assessing smoking-induced molecular alterations in the lungs[J].Cancer Prev Res(Phila)，2008，1(1):39-44.

[9]Abraham R,Pagano F,Gomella LG,et al.Chromosomal deletions in bladder cancer:shutting down pathways[J].Front Biosci，2007，12:826-838.

[10]Baffa R,Veronese ML,Santoro R,et al.Loss of FHIT expression in gastriccarcinoma[J].Cancer Res，1998，58（20）:4708-4714.