新疆大花红景天化学成分的HPLC-MS研究

霍佳丽，王建华*，吴志军，张国林

1重庆大学生物工程学院，重庆400044;2中国科学院成都生物研究所，成都610041

新疆大花红景天化学成分的HPLC-MS研究

霍佳丽1，王建华1*，吴志军2，张国林2

1重庆大学生物工程学院，重庆400044;2中国科学院成都生物研究所，成都610041

采用高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱法(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)，分别在正负离子模式下对新疆产大花红景天(Rhodiola crenulata)提取物进行分离分析。通过精确质量测定和同位素峰形匹配(SigmaFit)确定了化合物的元素组成。在正离子模式下，选择［M+H］+或［M+NH4］+准分子离子进行二级裂解对其结构进行分析。根据物质的元素组成和二级质谱信息，初步确定了新疆大花红景天提取物中的12种化合物。

新疆大花红景天;液质联用(HPLC-MS);红景天苷

景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)植物全世界约有90种，中国有70多种，主要生长于高寒山区［1］。作为红景天植物中研究较多的一种，大花红景天(Rhodiola crenulata)具有促进人体新陈代谢，增强细胞活力，提高人体免疫等功效，可用来治疗心衰、糖尿病、慢性肝病等疾病［2］。

根据目前国内外关于大花红景天成分的研究报道［3-5］，其有效成分主要为红景天苷及挥发油、黄酮、甾醇等。我们首次采用高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱法(HPLC-Q-TOF-MS)，对新疆大花红景天根茎中的化学成分进行分离鉴别，ESI-Q-TOF-MS具有高分辨率，可获得准确质量并产生多个可能分子式，再结合真实同位素分布模式SigmaFit算法，将实测同位素分布模式与理论计算的模式相比对，得到有统计意义的匹配因子——Sigma值，其值越小，说明同位素分布匹配性越好，据此可大大降低可能的分子式数目，进一步根据二级裂解碎片信息推测其结构，提供了一种快速、灵敏、准确的分离分析方法，旨在为合理开发利用大花红景天这一宝贵的药用植物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent公司); ESI-Q-TOF质谱仪(Bruker公司);离心机(Anke);甲醇(色谱纯，Fisher公司)，乙腈(色谱纯，百灵威公司);醋酸铵(分析纯，天津博迪化工有限公司);超纯水;大花红景天产自新疆清水河。

1.2 供试品溶液制备

取干燥新疆红景天适量，采用超纯水提取，滤液浓缩后依次用二氯甲烷、正丁醇分别萃取3次，合并水相萃取层，减压浓缩得浸膏。取浓缩样品少量溶于甲醇溶剂中，混匀，离心2 min，取上清液，制得待测样品。

1.3 分析条件

色谱条件:Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm ×150 mm);流动相A(1000 mL超纯水，0.5%甲醇，0.5%醋酸铵)，流动相B(乙腈)。梯度洗脱程序(0～6 min，流动相A:95%～92%;6～35 min，流动相A:92%～40%;35～40 min，流动相A:40%～20%);流速0.2 mL/min;柱温25℃;进样量15 μL。

质谱条件:电喷雾(ESI)离子源;ESI源电压: -500 V，毛细管电压:-4500 V(负离子模式下+4000 V)。雾化气体:高纯氮气(0.3 bar);样品进样速度: 180 μL/h。干燥气温度:180℃。干燥气流速:4.0 L/min。检测模式:正负离子模式。

2 结果与讨论

2.1 新疆大花红景天的HPLC-ESI-MS分析

在上述色谱条件下，各色谱峰得到较好的分离，分别在质谱正负离子模式下得到红景天苷等12个物质的准分子离子峰，如表1所示。其中化合物1、8、10、11和12正离子模式下得到［M+NH4］+准分子离子峰，其它的则为质子化的分子离子峰。12个物质在两种模式下均获得误差较小的精确质量和较小的mSigma值(其值越小，同位素匹配性越好)，根据其精确质量及同位素峰型匹配值，结合相关参考文献［6-8］已报道的大花红景天成分，推测了其可能元素组成，分子式见表1。

表1 大花红景天中主要成分HPLC-Q-TOF-MS分析Table 1 Analysis of Rhodiola crenulata by HPLC-Q-TOF-MS

2.2 新疆大花红景天的HPLC-ESI-MS/MS分析

在tR=6.2 min和tR=18.9 min分别观察到6号峰m/z 449.1054，12号峰m/z 466.2630准分子离子峰(见图1)，结合它们相应的负离子峰分子量，判断6号峰为［M+H］+，12号峰为［M+NH4］+，即两个物质质荷比m/z均为448，可推测两物质为新疆大花红景天中1对同分异构体。根据其精确分子量及同位素峰型匹配性可确定其分子式分别为C21H20O11和C21H36O10，又对其准分子离子分别进行二级裂解，m/z 449主要得到m/z 303和 m/z 287碎片，m/z 466断裂主要碎片峰为m/z 295、m/z 277、m/z 259、m/z 137，据此可推测6号为Rhodionin，12号为Sacranoside。

图1 正离子模式下总离子流图Fig.1 The total ion chromatogram mass spectrometry

表1的12种化合物中，2、3、4、6和7可能是具有类似结构的黄酮化合物(如图2所示)，均容易丢失侧链糖基。以化合物2为例，质子化的分子离子［M+H］+m/z 611容易依次失去1分子葡萄糖和1分子鼠李糖得到的m/z 449和m/z 303的碎片离子，图3给出了相应的碎片峰。

3 结论

新疆大花红景天的分离中，流动相采用水相(0.5%醋酸铵)和乙腈相梯度洗脱取得较好的分离效果和较好的质谱响应峰值。根据高分辨质谱精确的分子量和同位素峰型的匹配性，可以确定物质的分子式，再结合二级质谱碎片信息和大花红景天化学成分的相关文献报道，确认出12种化合物，其他的化合物还需进一步研究其化学结构。HPLC-ESIQ-TOF实现了复杂中药成分快速分离分析，为大花红景天指纹图谱的优化及微量成分的快速分析提供了一种有效的分析方法。

1 Bai Z，Nan P，Zhong Y.Chemical composition of the essential oil of Rhodiola quadrifida from Xinjiang，China.Chem Nat Compd，2005，41:418-419.

2 Kanupriya，Prasad D，Ram SM，et al.Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert-butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U-937 human macrophages.Mol Cell Biochem，2005，275:1-6.

3 Zhu MP(朱曼萍).Research of chemical composition and quality of Rhodiola crenulata.Beijing:Beijing University of Chinese Medicine(北京中医药大学)，MSc.2007.

4 Peng JN(彭江南)，Ma CY(马成禹)，et alStudies on chemical constituents bigflower Rhodiola(Rhodiola crenulata).Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，1995，26:177-179.

5 Aleksanteri P，Jorma J，Ari T.Identification of flavonoids of Rhodiola rosea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.J Chromatogr A，2006，1112:224-231.

6 Tao L，Hao Z.Identification and comparative determination of rhodionin in traditional Tibetan medicinal plants of fourteen Rhodiola species by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection and electrospray ionizationmass spectrometry.Chem Pharm Bull，2008，56:807-814.

7 Huang H，Liang MJ，Jiang P，et al.Quality Evaluation of Rhodiola crenulata:Quantitative and Qualitative Analysis of Ten Main Components by HPLC.J Liq Chromatogr Relat Technol，2008，31:1324-1336.

8 Ari T，Jouko U.Fast screening method for the analysis of total flavonoid content in plants and foodstuffs by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-offlight mass spectrometry with polarity switching.Rapid Commun Mass Spectrom，2004，18:3113-3122.

Analysis of Chemical Constituents of Rhodiola crenulata Using High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HUO Jia-li1，WANG Jian-hua1*，WU Zhi-jun2，ZHANG Guo-lin21College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China;2Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China

The extracts of Rhodiola crenulata in Xinjiang were investigated by high-performance liquid chromatography and electrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometry(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)in both positive-and negative-ion mode.Elemental compositions of compounds were confirmed by accurate mass and isotope analysis(the value of SigmaFit).Tandem MS was further applied for the structural analysis in positive-ion mode，and protonated or NH+4adduct precursor ions were selected for the fragmentation experiments.Twelve compounds，including a pair of isomer，from the extracts of R.crenulata were identified or tentatively characterized based on elemental compositions and tandem mass spectra.

Rhodiola crenulata(Xinjiang);HPLC-MS;salidroside

1001-6880(2012)10-1405-03

2011-11-15 接受日期:2012-01-16

国家科技支撑计划(2007BAD51B05)

*通讯作者 Tel:86-23-65102507;E-mail:wjh@cqu.edu.cn

R284.2

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