hSRD5A2体外药物筛选新模型的建立及在筛选药物上的应用

汪洋，汪兴生（1.马鞍山市医疗集团，安徽马鞍山243000；2.安徽中医学院药学院，合肥230038）

hSRD5A2体外药物筛选新模型的建立及在筛选药物上的应用

汪洋1＊，汪兴生2#（1.马鞍山市医疗集团，安徽马鞍山243000；2.安徽中医学院药学院，合肥230038）

目的：建立人类类固醇5αlphaⅡ型还原酶（hSRD5A2）体外药物筛选新模型，并用于中药提取物的筛选。方法：在体外建立hSRD5A2抑制剂模型，hSRD5A2、睾酮（T）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）一起组成了一个微量反应系统，对底物浓度、NADPH、hSRD5A2、温度和时间进行优化，并利用建立的模型筛选中药提取物。结果：当固定底物、NADPH、hSRD5A2的浓度分别为0.02µmol·L－1、0.8mmol·L－1、0.05u·mL－1时，在37℃反应60min，hSRD5A2达到了最大活性；芒果苷有显著抑制hSRD5A2活性的作用。结论：本研究建立的模型是一种简单可靠的筛选hSRD5A2抑制剂的方法；芒果苷可能成为一种治疗良性前列腺增生的药物。关键词 人类类固醇5αlphaⅡ型还原酶；良性前列腺增生；中药提取物；芒果苷；体外药物筛选模型

良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia，BPH）是前列腺尿道周围区细胞的良性腺瘤性增生[1]，是老年男性常发病。研究表明，BPH可能是患者类固醇5αlphaⅡ型还原酶（hSRD5A2）过度表达的结果[2]。hSRD5A2作用产生的双氢睾酮（DHT）在BPH发病机制中起主要作用，而人类类固醇5α lphaⅠ型还原酶产生的DHT作用很小[3]。非那雄胺是hSRD5A2抑制剂，治疗BPH安全有效[4]。本研究拟建立一种新的hSRD5A2抑制剂模型来筛选一些中药提取物，为研究抗BPH药物奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

GL21M型离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；ZF-1型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；202-1A型数显电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）；ZD-88B型恒温摇床（太仓市博莱特实验仪器厂）；DNP-9052型电热恒温培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；DYY-604型稳压稳流电泳仪（南京新校园生物科技研究所）；TC-25H型PCR仪（美国Thermo Electron公司）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；凝胶成像系统（德国UVP公司）；超声波细胞粉碎仪（上海比朗仪器有限公司）；ELx800型酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 试药

芒果苷提取物从中国植物多样性研究中心购买，其他中药提取物由安徽中医学院植物化学组提供并鉴定。质粒PcDNA3.1（+）、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、Protein Marker、肠激酶（EK酶）、0.1%牛血清白蛋白（大连宝生物工程有限公司）；质粒DNA小量试剂盒（爱思进生物技术（杭州）有限公司）；酵母提取物、蛋白胨（英国Hampshire公司）；谷胱甘肽S-转移酶（瑞士GE公司）；还原型谷胱甘肽（南京生兴生物技术有限公司）；非那雄胺、苯甲基磺酰氟（美国Biosharp公司）。

1.3 细胞与细菌

CHO细胞、大肠杆菌DH5α、pMD 18-T由安徽中医学院生物药剂实验室提供。

2 方法

2.1 建立hSRD5A2抑制剂筛选的模型

本研究室利用细胞培养、基因工程、Ni纯化等技术，获得高纯度hSRD5A2（含量：98%），置于96孔板，对照孔和试验孔重复3个，hSRD5A2、睾酮（T）和其他试剂一起有序地加入孔中进行反应，反应温度为37℃，反应时间为60min。反应结束后，反应的200μL液体转至其他96孔板的孔中。根据说明书的要求，DHT产量由EIA法测定；hSRD5A2的活性由DHT的产量来恒定。对还原型辅酶Ⅱ（NADPH）、hSRD5A2、T、时间和温度在微型反应体系中进行优化，建立体外筛选hSRD5A2抑制剂的模型。非那雄胺被选为hSRD5A2抑制剂的阳性对照，乙醇为阴性对照，通过上述方法评价筛选hSRD5A2抑制剂的模型。

2.2 中药提取

取各中药提取物，粉碎后以乙醇提取。乙醇提取物在真空蒸发器中浓缩，浸膏称重，用50%乙醇溶解成浓度为1%的溶液。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 T、NADPH、hSRD5A2浓度对hSRD5A2活性的影响

hSRD5A2反应体系由T、NADPH、hSRD5A2和磷酸钾缓冲液（pH7.0）组成。为了确定反应系统中T的最适浓度，固定hSRD5A2、NADPH的浓度和温度，研究T浓度与DHT产量的变化关系，可确认最佳的T浓度为0.02µmol·L－1。NADPH以不同浓度加入反应体系中，固定T和其他底物浓度不变，2h后通过EIA法检测DHT的产量。当NADPH的浓度为0.8mmol·L－1时，DHT的产量达到最高值，可确定NADPH的最适浓度为0.8mmol·L－1。为了确定反应体系中hSRD5A2的最适浓度，固定NADPH、T的浓度和温度，发现DHT产量的变化与hSRD5A2浓度的变化有关，可确定反应体系中hSRD5A2的最佳浓度为0.05u·µL－1。不同浓度的T、NADPH、hSRD5A2对hSRD5A2活性的影响分别见图1～图3。

图1 不同浓度的T对hSRD5A2活性的影响Fig 1 Effects of different concentrations of T on the activity of hSRD5A2

图2 不同浓度的NADPH对hSRD5A2活性的影响Fig 2Effects of different concentrations of NADPH on the activity of hSRD5A2

图3 不同浓度的hSRD5A2对hSRD5A2活性的影响Fig 3 Effects of different concentrations of hSRD5A2on the activity of hSRD5A2

由图1可知，当T浓度从0增加至0.02µmol·L－1时，DHT产量与T浓度增加成线性相关。当T的浓度增加至2.5、3.0、3.5µmol·L－1时，DHT产量不变，达到最高值。

由图 2可知，NADPH 的浓度以 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol·L－1分别加到反应体系的板孔中，当NADPH浓度从0.05mmol·L－1升至0.8mmol·L－1时，NADPH浓度与DHT产量成线性相关。结果表明，NADPH浓度与hSRD5A2的活性相关，高浓度的NADPH大大提高了hSRD5A2的活性，另外T转化为DHT的产量也相应提高。

由图3可知，当hSRD5A2浓度从0提高至0.05u·μL－1时，hSRD5A2浓度同DHT产量成线性关系，高浓度的hSRD5A2增加了DHT产量。当hSRD5A2浓度为0.05u·μL－1时，DHT产量显示最高值（规定0.00082g hSRD5A2为1u）。

3.2 时间和温度对hSRD5A2活性的影响

为了确定反应体系中最适反应温度和时间，固定hSRD5A2和NADPH浓度。2h后，当温度为37℃时，DHT产量达到峰值；以后，随着温度增加，DHT的产量逐渐下降。不同反应温度对hSRD5A2活性的影响见图4。另一方面，当反应温度为37℃，反应时间达到60min时，DHT产量达到最高值，随着反应时间加长，DHT产量不会增加。不同反应时间对hSRD5A2活性的影响见图5。

图4 不同反应温度对hSRD5A2活性的影响。Fig 4 Effects of different reaction temperatures on the activity of hSRD5A2

图5 不同反应时间对hSRD5A2活性的影响。Fig 5 Effects of different reaction time on the activity of hSRD5A2

3.3 一些中药提取物对hSRD5A2活性的抑制作用

笔者确定了hSRD5A2、NADPH、T浓度以及时间和温度。当非那雄胺的浓度从0.005µmol·L－1升至0.16µmol·L－1时，DHT含量与非那雄胺的浓度成线性关系。笔者筛选了大约20种中药提取物，如栀子苷、苦参生物碱、莪术醇、芒果苷、小檗碱、肉桂酸等，发现栀子苷、锁阳、紫茎泽兰、松树叶、黄芩苷、黄连、满杜鹃皮的水提物和醇提物对hSRD5A2没有或有非常弱的抑制作用（数据无显示）。芒果苷对hSRD5A2有显著的抑制作用，且该抑制作用明显优于新芒果苷，但两者都比非那雄胺弱。不同浓度的芒果苷对hSRD5A2活性的影响见图6。

图6 不同浓度的芒果苷对hSRD5A2活性的影响。Fig 6Effects of different concentrations of mangiferin on the activity of hSRD5A2

4 讨论

据报道，前列腺增生酶的体外模型是通过将鼠的同源组织匀浆化，其中混合了SRD5A1和SRD5A2，以及内源性NADPH[5]，或建立稳定表达hSRD5A2的细胞株作为抑制筛选模型[6]。笔者认为目前的研究有其局限性，hSRD5A2通过克隆和纯化获得，采用了外源性NADPH，这个反应系统的关键影响因素被分离开了。本试验中，笔者对底物、NADPH、hSRD5A2浓度与温度以及时间进行了优化。根据不同的pH值，hSRD5A2抑制剂的灵敏度是不同的，所以笔者选择中性作为hSRD5A2工作的最佳环境[7]。本研究建立了更可靠方便的BPH抑制剂的筛选模式。

在本研究中，确定了知母根提取物中的芒果苷对hSRD5A2具有抑制作用。另据报道，芒果苷具有抗氧化活性，能抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达和提高转化生长因子的表达，芒果苷对hSRD5A2的抑制作用是由于直接抑制hSRD5A2本身，而不是其非特异性抗氧化剂的潜力[8]。不过，也有可能是知母提取物的其他化合物可以竞争或非竞争性抑制造成的。其活性成分及其分子作用机制有待进一步研究。

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Establishment andApplication of in Vitro Novel Selection Model for hSRD5A2in Drug Selection

WANG Yang（Maanshan Municipal Hospital Group，Anhui Maanshan 243000，China）
WANG Xing-sheng（School of Pharmacy，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

OBJECTIVE：To establish a novel selection model for hSRD5A2in vitro，and apply it for the selection of TCM extracts.METHODS：The in vitro model for screening hSRD5A2inhibitor had been established，hSRD5A2and testosterone（T）as a substrate together with NADPH as a hydrogen supplier，were composed of a minim reactive system.The concentrations of substrate，NADPH and hSRD5A2，temperature and time were all optimized，and established model was used to screen TCM extract.RESULTS：When the concentrations of substrate，NADPH，hSRD5A2were 0.02µmol·L－1，0.8mmol·L－1and 0.05u·mL－1respectively，the maximum activity of hSRD5A2were achieved at 37℃ after 60min reaction，mangiferin has significant inhibitory effect on the activity of hSRD5A2.CONCLUSION：The model in this study is a convenient and reliable for screening hSRD5A2inhibitors，and mangiferin may be a potential medicine for curing the benign prostatic hyperplasia.

hSRD5A2；Benign prostatic hyperplasia；TCM extract；Mangiferin；In vitro drug screening model

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2012）31-2902-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.31.08

2011-11-06

2012-03-27）