植物质膜内在水通道蛋白PIPs的分子生物学研究进展

何勇清，方 佳，余敏芬，方仲相，江 波，潘寅辉，郑炳松

(1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安311300；2.浙江省龙游县林业局，浙江 龙游324400)

水分对于植物的生长、发育和繁殖是非常重要的。植物不断地从根部吸收水分，又不断地由气孔蒸腾水分。水分在植物体内运输有3种途径[1]:质外体途径、共质体途径和跨细胞途径。后2种统称为细胞到细胞途径[2]。水分的跨膜运输有3种方式:通过脂双层(胞膜)的自由扩散运输[3]、通过膜转运蛋白的运输[4]和通过水通道蛋白(也称水孔蛋白，aquaporin，简称AQP)的被动运输[5]。不同的植物或不同的生理状态，其运输途径和运输方式可能存在差别。作为主要内在蛋白(membrane intrinsic protein，MIP)大家族的成员之一，水通道蛋白有利于水分和其他小分子物质如过氧化氢[6]等的跨膜运输，参与了植物水分的长距离运输、细胞渗透平衡的调控以及气孔运动，种子萌发等生长发育过程[7]。根据AQP的定位及序列同源性和结构特征，目前通常将植物AQPs分为5类:位于质膜上的质膜内在蛋白 (plasma membrane intrinsic proteins，PIPs)，又可分为PIP1和PIP2亚类；位于液泡膜上的液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)，又分为α-TIP，β-TIP，γ-TIP，δ-TIP和ε-TIP等5个亚类；存在于共生根瘤类菌体周围膜上的类Nod26膜内在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)；小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins，SIPs)，分为 SIP1 和 SIP2 亚类； 类 GlpF(glycerol facilitator)膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins，GIPs)[8－10]。球蒴藓 Sphaerotheciella sphaerocarpa 基因组中除具有 PIPs，TIPs，NIPs，SIPs和 GIPs等 5类 AQP外，还具有 HIP (hybrid intrinsic proteins)和 XIPs (X intrinsic proteins)2个新类别。目前，HIP仅发现于球蒴藓中，而XIPs还存在于多种双子叶植物中。本文主要对植物质膜内在蛋白PIPs的结构特征、生理功能和调控机制等方面的研究进展进行介绍。

1 质膜内在蛋白PIPs的结构特征

PIPs定位于原生质膜上，所有的PIPs均高度保守，与植物种类无关[11]。孔道狭窄，为典型的高水分选择性通道蛋白。在所有已知的高等植物PIPs中，存在2个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN，分别位于C环和E环，可能与PIPs功能的特异性有关。PIPs分为PIP1和PIP2亚类[12－14]，两者的区别在N-端和C-端的不同[12]。PIP1比PIP2具较长的N-端和较短的C-端，而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。

2 质膜内在蛋白PIPs的功能

PTPs不仅是水和中性小分子选择性通道蛋白，同时还具有许多生理功能，是一类多功能蛋白(表1)。

表1 质膜内在蛋白的结构特性及其功能Table 1 Structural characters and function of the plasma membrance intrinsic proteins

2.1 PIP1

在拟南芥Arabidopsis thaliana中，各PIP1之间的氨基酸序列具有90%相似性[32]。尽管PIP1在选择透性功能区域的氨基酸残基与PIP2类似[33]，但它们的渗透性和在细胞中的生物学功能不尽相同。作为质膜PIP1家族成员之一，烟草Nicotiana tabacum NtAQP1表达下降引起根系水分通透性下降，并降低烟草的抗旱性[15]。这些结果在拟南芥PIP1/PIP2反义突变体的研究中也得到了证实[34]。在豌豆Pisum sativum种子吸胀过程中，PIP1在吸收水分方面起到了非常重要的作用[18]。但是PIP1在爪蟾Xenopus oocytes卵母细胞或其他表达系统的异源表达中则显示没有或非常低的水通道蛋白活性[22－23，27,35-36]，PIP2转运水分的能力比PIP1大得多[12，22]。PIP1的低水分运输能力，不知是植物本身的一种调控水分运输的机制，还是由于爪蟾卵母细胞异源表达系统不能对它进行正确的翻译、折叠、定位或调控所致[37]。与此相反，在某些情况下其运输小分子物质如甘油、二氧化碳(CO2)的渗透性增加了[16，35]。实验研究证明烟草NtAQP1在爪蟾卵母细胞表达中具有运输二氧化碳的功能[16]。该卵母细胞注射了NtAQP1的cRNA和碳酸酐酶(碳酸酐酶的功能是加速二氧化碳转化为HCO3－)，因此，加快了二氧化碳从胞外跨膜运输到胞内，从而导致了细胞内pH值降低[38]。研究发现，转烟草NtAQP1的爪蟾卵母细胞二氧化碳吸收量比对照高了45%。二氧化碳运输功能最早是在人的AQP1中发现[39]，并且证明与水通道蛋白的通气功能有关，而不是膜脂组成成分或膜内在其他基因的表达对爪蟾卵母细胞二氧化碳渗透吸收的影响[40]。

随着AQP在动物中介导二氧化碳运输的生理机理不断地得到验证，有关AQP在植物中介导二氧化碳运输的生理机制也越来越清楚。在超表达AQP转基因烟草或反义表达AQP转基因烟草的研究中都证明了它对水分运输和依赖二氧化碳的光合代谢影响[15-16]。当用低浓度的氯化汞(HgCl2)处理蚕豆Vicia faba或菜豆Phaseolous vulgaris的离体叶片圆盘时，其质膜水分渗透性下降了70%～80%，同时光合作用固定二氧化碳能力和二氧化碳从细胞间隙转运到叶绿体基质的导度也都下降了。这表明植物是通过叶肉细胞质膜由汞敏感的水通道蛋白来吸收二氧化碳[41]。在生长良好条件下，过表达拟南芥AtPIP1；2基因的烟草可以显著提高蒸腾速率，增加气孔密度和光合效率[19]。近期研究表明，在拟南芥水分运输中AtPIP1；2是关键组成部分[42]。因此PIP1水通道蛋白不仅具有水分运输的功能，而且具有运输小分子物质或气体的功能，如 HvPIP1；3 和 HvPIP1；4 能运输硼[43]。

2.2 PIP2

水通道蛋白PIP2亚家族似乎比PIP1运输水分的效率更高。在各种利用爪蟾卵母细胞或酵母膜囊泡作为异源表达系统的研究表明，水通道蛋白PIP2的水分渗透性比对照增加5～20倍[14,44]。一般情况下，水通道蛋白PIP2具有较短的氨基末端和较长的羧基末端。迄今为止，PIP2亚家族的各个蛋白在不同的物种中具有不同的生物学功能，并已证明它们对植物不同的生理进程起到非常重要的作用。这些水通道蛋白可在根系、 叶片[24，34]、 生殖器官[45－46]和种子萌发等[18]生长发育过程中参与水的运输。

Chaumont等[22]从玉米Zea mays中克隆到一个水通道蛋白ZmPIP2，研究发现在爪蟾卵母细胞中瞬时表达ZmPIP2，其水分膜透性可增加8倍以上。氯化汞可以可逆抑制水通道蛋白ZmPIP2的功能。Moshelion等[27]从豆科Leguminosae雨豆树Samanea saman叶枕细胞膜上克隆到一个PIP2蛋白SsAQP2，研究表明，SsAQP2的表达可提高水分膜透性20倍以上。同时SsAQP2的功能不仅能被氯化汞所抑制，而且也能被另一种水分运输抑制剂根皮素(phloretin)所抑制。

烟草NtPIP2；1是与有性生殖有关的基因，它对花粉粒附着在子房上的水合作用很重要，它促进了水分在细胞间或组织间的运动[45]。Marc等[46]利用烟草PIP2的RNAi植株和免疫定位技术分析PIP2的定位模式。在花粉囊发育过程中PIP2的表达受到调控；与对照相比，烟草PIP2的RNAi植株的花粉脱水作用更慢，开裂更迟。PIP2亚家族的成员在烟草的花粉囊有效开裂中是必需的。

PIP2s的表达也具有发育阶段的特异性。野生马铃薯Solanum chacoense的ScPIP2A由受精诱导，在花瓣近成熟时减少，但在伸长的花柱、雄蕊、受精后的子房中强烈表达。花柱中大量表达与花柱伸长及表皮组织的形成有关。ScPIP2A在生长的果实中也强烈表达，它在发育成熟细胞的膨胀中起功能作用[47]。

Johansson等[31]从菠菜Spinacia oleracea中克隆到一个PIP2类蛋白SoPIP2；1，它定位于叶片质膜。Tornnroth等[30]进一步研究表明，蛋白SoPIP2；1多聚体化构成的通道的开闭是由于2个丝氨酸残基的磷酸化和去磷酸化而引起的。2个丝氨酸残基分别是胞质环B中的Ser115和C末端的Ser274。Ser115去磷酸化后，D环的Arg190和Asp191通过带3个水分子的氢键网格与侧链的Arg118(在PIPs中严格保守)和Gly30相连，通过二价阳离子互作把D环锚定与N末端的短α-螺旋上。Ser115的磷酸化使把D环锚定与N末端的氢键网络瓦解。Ser274与邻近单体的Pro199和Leu200主链上的氮发生互作。当这些互作丧失时，C末端絮乱，且原先Ser274侧链所占的位置被Leu197主链羰基上的氧取代。因此消除了空间排列的冲撞，螺旋5的N末端能额外反方向转180°伸向细胞质，于是取代Leu197并打开了水通道。

除了运输水分之外，水通道蛋白PIP2也能运输二氧化碳。通过大麦Hordeum vulgare水通道蛋白HvPIP2；1在水稻Oryza sativa中过量表达证明PIP2有助于促进二氧化碳运输[28]。叶肉细胞气孔导度是由叶片的气体交换和碳同位素的比值来决定的。研究发现:HvPIP2；1与气孔导度密切相关，表明水稻叶片HvPIP2；1具有促进二氧化碳运输的作用。但水通道蛋白的表达和二氧化碳通透性的增加是否仅仅与HvPIP2；1的功能有关还有待于进一步研究。

3 质膜内在蛋白PIPs的调控机制

3.1 PIP1s

到目前为止，研究发现TIPS和NIPS具有磷酸化调控机制，但PIP1却没有这个功能。因为当玉米Zea mays PIP1；2在卵母细胞中表达时，增加蛋白激酶A激活剂或磷酸酶抑制剂都未能增加其水分渗透性[22]。但PIP1具有翻译后修饰的功能，Western杂交结果表明PIP1在根系和叶片中表达不同。大于28 kDa的水通道蛋白多肽可以在根系细胞中表达，但在叶片细胞中却没有表达，因此可能是由于PIP1存在翻译后调控如磷酸化或糖基化的作用。最近，通过水通道蛋白异聚化作用对水分渗透率的影响的研究表明，与单个玉米PIP1蛋白表达相比，2个玉米PIP1亚型共表达可以增加其质膜透水性[23]。这些结果进一步证明了PIP1异聚化对它发挥运输水分功能是必需的。

3.2 PIP2s

二价阳离子和pH值也能够影响质膜透性[48]。细胞液导度是通过在拟南芥的悬浮细胞使用细胞压力传感器和添加不同的溶质来测定的。添加钙离子可以降低细胞液导度4倍以上。这个结果也在纯化的质膜囊泡和停流分光光度计的测量(stopped flow spectrophotometer measurements)中得到证实。在拟南芥细胞内由于缺氧而酸化导致了根细胞膜水分渗透下降[20]。在爪蟾卵母细胞内异源表达拟南芥水通道蛋白时pH值下降导致水分渗透性降低的研究表明，水通道蛋白的关闭受H+的影响。后来的研究证明:在AtPIP2；2组氨酸残基D环197位氨基酸被确定为主要的pH感应点[20,49]。在AtPIP2；2的结构模型中有质子化His197，导致D环在孔隙折叠，引起蛋白质的关闭。Tornroth等[30]研究揭示，在淹水条件下由于缺氧而使细胞质的pH值下降，PoPIP2；1的His193残基(在PIPs中严格保守)会发生质子化。当His193残基被质子化时，组氨酸残基侧链的单一旋转能使它与Asp28残基(在PIPs中Asp或Glu残基保守)之间形成盐桥。在这一模式下，由于Ser115残基的磷酸化而丧失的、由氢键所调控的把D环锚定于N末端的作用得以恢复，水通道蛋白的胞质一侧被D环加帽，由Leu197，Pro195和Val194残基有效地阻塞了水通道。

除了上述调控机制外，膜蛋白多聚化也能调控水通道蛋白的运输功能[50]。为了研究多聚化对水通道蛋白PIPS功能的影响，不同的PIP1s和PIP2s在爪蟾卵母细胞中共表达[23，36]。研究表明:注入玉米水通道蛋白3 ng PIP2的cRNA，同时加3～12 ng的PIP1 cRNA能够提高水的通透性。通过构建PIP1-GFP载体，转基因研究也发现PIP1蛋白表达明显增强。最新研究发现，大麦HvPIP2不仅在爪蟾卵母细胞中单独表达时显示出水通道活性，而且在HvPIP1和HvPIP2共表达时活性显著增强[51]。水分通透性的增强可能是由于形成PIP1和PIP2的异源多聚体。通过镍柱层析技术也直接证明了它们的相互作用。通过PIP1和PIP2的有效折叠，增强了蛋白之间的稳定性，从而增加了水的通透性。

ZmPIP1；2和不同的ZmPIP2在爪蟾卵母细胞中共表达，不同组合在水通道蛋白活性上均表现阳性协同作用，这可能是质膜靶向作用提高的结果[23]。利用亲和层析证实了ZmPIP1；2和ZmPIP2间的物理互作导致质膜上异源四聚体中ZmPIP1；2的高表达[23]。尽管ZmPIP1；1和ZmPIP1；2在分别表达时活性较低，但当它们共表达时活性提高。ZmPIP1；2和ZmPIP2；5共表达也提高水通道蛋白活性，但ZmPIP1；1和ZmPIP2；5之间未见互作。在这些共表达实验中，ZmPIP1；1LE突变体发挥的作用与ZmPIP1；2相同。因此推断，ZmPIP1在这些异源四聚体行使水通道功能时是必不可少的。

PIP1和PIP2亚型几乎存在于所有植物组织器官中如根系和叶片。这些植物组织器官具有完全不同的形态和生理功能，如:关于水或二氧化碳的运输。因此，不同的植物细胞具有不同的水分或气体渗透性，水通道蛋白的功能是根据各个植物组织或细胞需要而不同。在一些叶片细胞膜PIP可能充当小分子物质或气体的运输通道，而在根系中这些PIP可以通过修饰或与其他水通道蛋白的互作而起到运输水分的功能。由于试验研究证明高透水性PIP亚类可能是共质体和质外体水分运输的主要途径，因此通过不同的调控机制，水通道蛋白能够通过各种细胞到细胞的运输途径的调控来响应生物胁迫和非生物胁迫。

4 展望

目前，人们对PIP的研究正逐步深入，但究竟有多少种水通道蛋白参与水分和小分子物质的运输，它们之间的相互关系以及它们对运输水分和小分子物质的调控机制还有待进一步探讨。因此，明确水通道蛋白的种类及其基因表达调控，并联系它们在植物生长发育过程中的生物学功能是揭示水通道蛋白的必然途径。

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