C型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺优化

朱良全，李聪研，蒋玉文，田冬青，孙 晔

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.北京中海生物科技公司，北京 100081)

产气荚膜梭菌(Clostridum perfringens)，又称魏氏梭菌(Clostridum welchii)，依据其主要致死性毒素与其抗毒素中和试验，可将此菌分为A、B、C、D和E 5个型[1]。C型产气荚膜梭菌(Clostridum perfringens)是引起动物出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌。特别对新生幼畜和幼禽(尤其是新生仔猪)，易引起高致病性和高死亡率。其主要的毒力因子为α、β1和β2毒素，这3种毒素毒力均很强，且均具有良好的免疫原性[2-3]。

目前，我国C型产气荚膜梭菌病灭活疫苗生产采用的厌气肉肝汤或肉肝胃酶(膜)消化汤培养基存在以下突出问题[4]:①成分复杂，难以标准化;②广谱性高，专一性弱;③制作繁琐，需经验因素。鉴于此，本试验在研制成功C型产气荚膜梭菌合成培养基基础上，进行C型合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺的研究，为生产工艺的技术革新奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 C型产气荚膜梭菌CVCC60102株(原C59-2株)，由中国兽医药品监察所菌种保藏室鉴定、保管和供应。

1.1.2 培养基及溶液 厌气肉肝汤，批号20091223;肉肝胃酶消化汤，批号分别为20100105、20100112、20100119;明胶缓冲液(稀释毒素用)，批号20100201。由中国兽医药品监察所提供。C型产气荚膜梭菌合成培养基主要成分为蛋白胨、酵母粉、硫乙醇酸钠、半胱氨酸盐酸盐等，批号201011，由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 实验动物 小白鼠，CD-1品系，16～20 g，SPF级，由北京维通利华实验动物有限公司提供。

1.1.4 浓缩设备 Easy-load蠕动泵，MODEL，NO.XX80EL230;PERMEATE，CAT，NO:X142POO.80;0.5 m2的8 ku及10 ku截留分子量(MW)超滤膜来自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 产气荚膜梭菌CVCC60102株种子液的制备 将C型产气荚膜梭菌(CVCC60102)冻干菌种用1 mL肉肝胃酶消化汤稀释后，吸取菌液0.1 mL接种于10 mL的肉肝胃酶消化汤中，置37℃静置培养18～24 h，作为种子液。

1.2.2 菌液的培养 按说明书称取C型合成培养基，用相应体积的去离子水将各成分充分溶解，调pH值至8.3，116℃灭菌30 min，待温度降至室温，将种子液按培养基体积的1%接种，37℃静置培养18 h。

1.2.3 毒素的制备 培养好的菌液以3000 r/min离心30 min，吸取上清，0.22 μm滤膜过滤除菌，即为毒素，-20℃冻存备用。

1.2.4 菌液毒力(MLD)的测定 将毒素用明胶缓冲液作适当稀释，使0.2 mL稀释液中分别含有0.001 mL(200×稀释)、0.002 mL(100×稀释)、0.003 mL(66×稀释)和 0.004 mL(50×稀释)的毒素，各静脉注射16～20 g的小白鼠2只，每只0.2 mL，在24 h内全部死亡的最大稀释度乘以5，即为每1 mL毒素所含的最小致死量(MLD)数。

1.2.5 pH值对合成培养基产毒的影响 配制C型培养基溶液各1000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液分别调整 pH 值至 7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6，116 ℃ 灭菌 30 min。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4项方法进行培养及毒力测定，各进行3批，批号分别为 C1001、C1002、C1003。

1.2.6 高压灭菌对合成培养基产毒的影响 配制C型培养基溶液各1000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至8.3.分别以116℃灭菌30 min、121℃灭菌15 min、121℃灭菌30 min。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4项方法进行培养及毒力测定，共进行3批，批号分别为 C1011、C1012、C1013。

1.2.7 配制用水对合成培养基产毒的影响 对C型合成培养基分别用去离子水、反渗透纯化水、蒸馏水配制成1000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液预先调整pH至8.3。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4项方法进行培养及毒力测定，共进行3批，批号分别为 C1021、C1022、C1023。

1.2.8 合成培养基培养条件的确定 按说明书配制C型培养基6瓶，1000 mL/瓶，将种子液按培养基体积的1%接种，其中1瓶置37℃培养20 h，期间分别于 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 先后取样5 mL;另外5 瓶，分别置 35、36、37、38、39、40 ℃培养18 h后取样5 mL，然后按1.2.3、1.2.4项方法取其上清进行毒力测定，确定最佳产毒的时间和培养温度。

1.2.9 配制成的培养基与传统培养基对比试验按上述筛选条件配制 C型培养基3批，1000 mL/批，批号为 C201001、C201002、C201003，与3 批肉肝胃膜消化汤进行比较。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4项方法进行培养及毒力测定。

1.2.10 C型合成培养基浓缩工艺的优化 配制C型培养基5000～6000 mL，并按上述优化条件培养产气荚膜梭菌CVCC60102株，培养好菌液经3000 r/min离心30 min，去除菌体，分别用不同截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行浓缩，然后进行浓缩前、后体积定量，并取浓缩前、后及透出液样品各10 mL按1.2.4项方法进行毒力测定。

2 结果

2.1 C型产气荚膜梭菌合成培养基pH值、高压条件、培养用水优化 结果如表1、表2和表3所示。从表1、表2和表3结果可以看出，最适pH值为8.0～8.4，灭菌条件为116℃、30 min，配制用水为去离子水。

表1 不同pH值培养基的产毒结果(MLD/mL)

表2 不同高压条件培养基的产毒结果(MLD/mL)

2.2 不同培养时间及培养温度 产毒结果如表4、表5所示。从表4和表5结果看出，合成培养基培养CVCC60102株18 h毒力达500～1000 MLD/mL，随着时间的延长，毒力不再增强;培养温度为36℃或37℃，产毒效果最佳。

表3 不同配制用水条件下培养基产毒结果MLD/mL

表4 不同培养时间产毒结果 MLD/mL

表5 不同培养温度下产毒结果 MLD/mL

2.3 合成培养基与肉肝胃膜消化汤对比 结果见表6。从表6看出，C型合成培养基可替代传统培养基。

2.4 培养毒素浓缩条件优化 结果见表7。从表7看出，10 ku截留分子量的收获率为68%，其透出液静脉接种0.2 mL，小鼠2/2死亡;而8 ku收获率达80%，其透出液静脉接种0.2 mL，小鼠0/2死亡。

表6 合成培养基和肉肝胃酶消化汤毒力比较结果

表7 不同截留分子量的膜包浓缩结果

因此8 ku截留分子量的膜包适宜对C型菌培养毒素的浓缩。

3 小结与讨论

3.1 α、β1和β2毒素是C型产气荚膜梭菌主要分泌毒素，也是主要免疫原，其分子量分别为42.5、34.5、28 ku[1，5]。影响毒素产量因素较多，比如菌株类型、菌株毒力、培养时间、培养基pH值、培养温度、培养过程中的溶解氧和培养基组成及各组分的比例等[6]。通过对C型合成培养基使用参数进行试验，确定最适pH值为8.0～8.4;灭菌方式为116℃、30 min;配制用水为去离子水;合成培养基培养产气荚膜梭菌CVCC60102株18 h后毒力达500～1000 MLD/mL，随着时间的延长，毒力不再增强;培养温度在36℃或37℃时，产毒效果最佳。合成培养基按照细菌营养代谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高产毒性能的生长因子，具有产毒量高、成分相对确定、质量稳定、操作简便等优点，易于在线检测、监控和及时调整。上述数据为C型合成培养基的应用提供了使用参数。

3.2 超滤浓缩具有样品量大、处理快速、重复利用率高等特点，适合大规模生产，现已广泛应用于兽用生物制品疫苗的生产。在完成A型产气荚膜梭菌培养毒素浓缩工艺的基础上，开展了C型产气荚膜梭菌培养毒素浓缩工艺的优化。分别用不同分子截留量的millipore超滤浓缩系统进行浓缩，10 ku截留分子量收获率为68%，其透出液含毒素，且能致死小鼠;8 ku截留分子量的收获率达80%，其透出液不含毒素，因此用8 ku截留分子量膜包适宜对C型菌培养毒素进行浓缩，这与A型菌一致。但本试验浓缩仅达12.5倍，耗时需60 min，浓缩倍数远低于A型，而且耗时长于A型(数据未发表)，可能由于C型菌同时主要含有α、β1和β2三种毒素，另外β1和β2毒素分子量相对低，截留后很快产生较高的浓度，因而耗时长。因C型菌所产毒素毒力强，每毫升致死量是A型的5～10倍，因而12.5倍浓缩效果足够进行禽坏死性肠炎灭活疫苗和多价梭菌灭活苗的研制和生产。

3.3 通过完善A型及C型产气荚膜梭菌合成培养基的使用参数及培养毒素浓缩工艺，为下一步开展禽坏死性肠炎(A型+C型)二价灭活疫苗研究奠定了基础。

[1]陆承平.兽医微生物学[M].第4版.北京:中国农业出版社，2010:193-195.

[2]Gibert M，Jolivet-Reynaud C，Popott M R，et al.Beta2-toxin ，a novel toxin produced by Clostridium perfringen[J].Gene，1997，20(3):65-73.

[3]韩学波，曾 瑾，王玉炯，等.C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性[J].中国生物制品学杂志，2008，21(3):201-204.

[4]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版[S].

[5]许崇波.C型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展[J].大连大学学报，2006，27(2):1-5.

[6]Gale E F，Van Heyningen W E.The effect of the pH and the presence of glucose during growth on the production of alpha and theta toxins and hyaluronidase by Clostridium welchii[J].Biochem J，1942，36(7/9):624-630.