IBDV感染对SPF鸡腔上囊与外周血单核细胞TLR3／4／15 mRNA表达的影响

郭新风，王丽琼，李焕荣，阮文科，崔德凤，王 宁，刘凤华

［北京农学院动物科学技术学院，北京市兽医学（中医药）重点实验室，CAU－BUA TCVM教学与科研团队，北京 昌平102206］

宿主细胞的 Toll样受体（Toll－like receptors，TLR）通过识别病原微生物保守的分子相关模式，诱导天然免疫信号而激活炎性细胞因子，上调共刺激因子而激活细胞免疫，发挥抗病毒反应［1］。TLR3能诱导干扰素Ⅰ型的释放；TLR4可介导炎症反应；TLR15在病毒感染中有报道，可能在机体先天性免疫中发挥作用［2－3］。

鸡传染性腔上囊病毒（IBDV）主要侵害腔上囊内具有IgM的B淋巴细胞，引起严重而长期的免疫抑制，导致免疫失败，影响多种病毒疫苗的免疫应答［4］。IBDV感染可启动机体先天性免疫，通过巨噬细胞释放各种细胞因子抵抗病毒感染［5］；通过增强T淋巴细胞功能启动获得性免疫［6］。腔上囊单核细胞（BBMC）和外周血单核细胞（PBMC）作为机体重要的免疫细胞，其表面的模式识别受体在IBDV入侵中的识别作用及启动免疫反应的机理少有报道。本试验使用相对荧光定量PCR技术，通过分析IBDV感染对SPF鸡BBMC和PBMC在感染后不同阶段TLR3／4／15mRNA表达的影响，探讨IBDV感染对固有免疫反应的影响，为进一步研究IBDV发生过程中宿主与病原相互间的关系奠定基础。

1 材料

4周龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；鸡传染性腔上囊病毒（IBDV）BC6／86毒株，购自中国兽医药品监察所；Trizol，购自In－vitrogen（美国）公司；淋巴细胞分离液，购自TBD公司。

2 方法

2.1 动物分组及攻毒 4周龄SPF鸡30只，对照组和攻毒组各15只，再随机分为3组，每组5只。点眼途径感染IBDV BC6／85株标准强毒，50倍的囊最小感染量（BID）／只鸡，对照组给予相同剂量的生理盐水。

2.2 腔上囊和外周血单核细胞的制备 分别在感染后1、5、15d采集鸡心脏EDTA抗凝血，按照鸡淋巴细胞分离液说明书介绍的步骤进行鸡外周血单个核细胞（PBMC）分离，台盼蓝计数，配成1×106个／mL浓度的悬浮液，－80℃贮存备用；无菌取腔上囊，去除表面的脂肪组织、被膜等，2%犊牛血清的1640冲洗，刀背刮取腔上囊内淋巴细胞于2%1640培养基中，分别进行150目筛和300目筛过滤离心，同PBMC步骤分离鸡腔上囊单个核细胞，台盼蓝计数，配成1×106个／mL浓度的悬浮液，－80℃贮存备用。

2.3 引物的合成与RNA的反转录 根据Gen－Bank上各基因的序列，用Primer 5.0在保守区设计各自的特异PCR引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

表1 β－actin、TLR3、TLR4与TLR15扩增引物的序列和反应条件

按照Trizol说明书提取细胞总RNA。反转录在20μL体系中进行，1μL总RNA，DEPC水11 μL，Oligo（dT）0.5μL，70℃5min，M－MLV RT 5×Buffer 4μL，dNTP 2μL，MgCl21μL ，Ribo－nucelase Inhibitor 0.5μL，42℃ 60min，70℃15 min。反转录产物置－80℃冰箱备用。

2.4 SYBR GreenⅠ相对荧光定量RT－PCR检测方法的建立 本试验选用β－actin作为参照基因［7］。将β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的阳性cDNA进行10系列稀释成6个梯度作为模板，利用各自的特异性引物进行real－time PCR建立各自的标准曲线。20μL PCR反应体系：10μL SYBR Green Real－time PCR Mix，1μL Rox Buffer，0.6μL上游引物，0.6μL下游引物，模板1μL，加水至20μL 。PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，共40个循环。根据荧光值的变化，系统自动生成标准曲线。扩增效率基本一致时方可采用相对荧光定量比较CT值［8］。

2.5 统计分析 应用SPSS13.0对数据进行方差分析，P≤0.05表示差异显著。使用2△△Ct法对感染后不同时间的toll样受体分子进行比对。

△△Ct＝（Ct目的基因－Ct看家基因）×试验组－（Ct目的基因－Ct看家基因）×对照组

2－△△Ct表示的是试验组目的基因表达对于对照组的变化倍数。

3 结果与分析

3.1 β－actin、TLR3、TLR4 和 TLR15 荧光定量PCR标准曲线的建立 以10倍系列稀释的β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的阳性cDNA标准品为模板进行real－time PCR，得到检测用 β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的荧光定量PCR溶解曲线（图1）和标准曲线方程：

Y＝－4.017＊log（x）＋0.67，R2＝0.998；Y＝－4.128＊log（x）＋6.33，R2＝0.996；Y＝－4.097＊log（x）＋14.31，R2＝0.991；Y＝－4.089＊log（x）＋9.33，R2＝0.997

图1 TLR3、TLR4、TLR15及 β－actin基因的SYBR Green I rea－l time PCR 溶解曲线

溶解曲线表明，扩增产物形成单一的特异性溶解峰，其Tm值介于82.6℃～87.6℃之间。标准曲线方程表明，标准品起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系，相关系数r2均达到0.991以上，且TLR3、TLR4和TLR15与β－actin曲线斜率值相差小于0.1，可用于β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的mRNA水平相对定量分析。

3.2 TLR3、TLR4和TLR15相对荧光定量结果分析 如图2所示。与对照组相比，BBMC中TLR3的mRNA表达水平在IBDV感染后1d和感染后5 d均上调，差异显著（P≤0.05），PBMC中仅在感染后1d显著上调；感染后15dBBMC中TLR3恢复到正常水平，而PBMC中TLR3表达仍极显著高于对照组（P≤0.01）。

差异显著（P≤0.05），PBMC中 TLR4的 mRNA表达水平在感染后始终高于对照组，且在感染后15d极显著高于对照组（P≤0.01）。BBMC中TLR15的mRNA表达水平在感染后1d显著高于对照组（P≤0.05），感染后5d和15d无显著差异；而PBMC中TLR15mRNA表达水平在感染后1d极显著高于对照组（P≤0.01），在感染后5d和15d未检测到。

图2 感染后不同时间BBMC和PBMC中TLR3／4／15mRNA水平

4 讨论

Toll样受体是固有免疫中重要的识别受体，在机体识别各种病原微生物方面起着重要的作用。检测Toll样受体在感染初期（1dpi）、急性感染期（5dpi）与恢复期（15dpi）的 mRNA 表达水平变化，可探讨IBDV感染对机体免疫反应的影响。本试验应用实时荧光定量PCR方法，构建了内参基因β－actin及TLR3、TLR4、TLR15的标准曲线，利用内参基因β－actin消除mRNA的提取效率和反转录效率间的差异，结果可信度高，为检测鸡TLR3、TLR4、TLR15的表达水平提供了方法。

TLR3主要识别双链RNA分子，在人类类风湿性关节炎等自身性免疫性疾病中的表达上调［9］。刘爵等应用间接免疫荧光和免疫印记技术验证在TLR3基因沉默的细胞里，病毒VP2蛋白表达量下降，细胞中病毒滴度下降［10］，表明 TLR3在IBDV感染过程中起重要作用。本试验中，BBMC和PBMC中TLR3mRNA表达水平在不同的时间段均表达上调，且差异显著，推测TLR3可能在机体识别病毒中起作用。TLR4存在于多种细胞中，主要识别细菌的脂多糖，近年来有哺乳动物在病毒感染中TLR4表达量变化的报道［11］，证明TLR4在病毒的免疫防御中有重要作用，推测TLR4在禽类病毒感染中可能有相似的作用。本试验中，BBMC和PBMC中，TLR4mRNA表达在急性感染期及恢复期均显著上调，提示TLR4参与了IBDV感染过程中机体免疫系统的激活，IBDV感染后引起的腔上囊急性损伤可能与TLR4介导的炎性反应有关。TLR15是禽类特有的Toll样受体，有报道鸡感染马立克等病毒后也导致TLR15表达上调［12］。本试验显示，BBMC和PBMC中TLR15的mRNA表达水平在感染后1d均显著高于对照组，表明TLR15在感染初期识别IBDV感染中起到重要作用。此后，TLR15在BBMC中恢复至正常水平，而在PBMC中未检测到，提示IBDV感染后期PBMC中TLR15mRNA表达受到抑制。最近有报道，球虫感染的鸡肠道TLRs的表达下调可能导致鸡肠道免疫功能紊乱，增加机体对其他疾病的易感性［13］，推测TLR15在IBDV感染中有相似的作用。

综合分析表明，IBDV感染后鸡腔上囊单个核细胞和外周血淋巴细胞中TLR3、4、15mRNA表达均有不同程度的上调，提示IBDV感染早期激活了机体的固有免疫反应，发挥抗病毒作用，其识别病毒的机理及在免疫应答中的作用有待于进一步研究。

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