反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体对裸鼠膀胱癌生物学行为的影响

李然伟，魏 巍，刘禄成，温都苏，陈秀玲

（吉林大学第二医院 泌尿外科，吉林 长春130041）

膀胱癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均呈上升趋势，严重威胁人民的生命与健康。目前越来越多的证据表明，微小RNA（microRNA，miRNA）是调节多种肿瘤细胞增殖和凋亡的重要分子［1，2］。miRNA－21是 miRNA 家族的成员之一，在进化上高度保守，被认为具有癌基因的功能［3］。肿瘤抑素（Tumstatin）是一种内源性的血管生成抑制因子与细胞凋亡启动子，具有2个抗肿瘤活性区，不仅通过特异性地抑制血管内皮蛋白合成导致内皮细胞凋亡，使肿瘤新生血管形成受阻，还可抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，从而遏制肿瘤生长，因此被普遍认为是一种抑癌基因［4，5］。研究证实，肿瘤的发生发展是一个多步骤，多基因参与的复杂过程，这其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。肿瘤的发生是由于这一平衡体系失调所致。据此推测，研究反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体在裸鼠膀胱癌生物学行为中的作用，对临床膀胱癌的研究治疗也可能具有极其重要的实用意义。鉴于尚未见到有关这方面的文献报道，现将我们的实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人膀胱癌T24细胞株购自中科院上海分院细胞所；BALB／C雌性裸鼠20只，10－12周龄，体重（30±2）g，由中科院上海实验动物中心提供；原位肿瘤细胞增殖与凋亡检查试剂盒及即用型HIGH－SABC免疫试剂盒购自Boster；反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体由本研究室制备保存［6，7］。

1.2 研究方法 ① 动物模型的制备：参照文献［7］，用0.25%胰酶消化，收集对数生长期的T24培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640细胞培养液调整细胞浓度至1×107个／ml。自尿道插入22G静脉留置针套管，针芯轻划膀胱底部粘膜，使黏膜损伤范围大小约0.5×0.5cm后立即经套管灌注1.5 ml细胞悬液。② 灌注后第28天，采用活体动物体光学成像技术挑选出肿瘤大小基本一致的10只成瘤裸鼠，放入同一饲养笼内，然后随机抓取，编为1－10号，分笼单独饲养，单号鼠为治疗组，双号鼠为对照组。治疗组灌注反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体30μg（1.5ml），1周1次，共4次；对照组则每次用等剂量的PBS，治疗后第7天分别通过活体动物体光学成像技术测量肿瘤的长径和短径，以长（mm）和宽（mm）表示肿瘤大小，随后处死所有裸鼠。盆腔淋巴结在目测筛选后再行组织病理学检查以最终确定微转移情况。③ 应用SABC免疫组化方法并结合MTT和TUNEL技术分别检测T24细胞株增殖与凋亡。取5μm厚的石蜡切片，依次脱蜡水化，新鲜配制的3%H2O2（甲醛溶液配制）作用15min，阻断内源性过氧化物酶活性，蛋白酶K在37℃消化10min暴露抗原，标准枸橼酸盐缓冲液（0.1mol，PH6.0）煮沸3min修复抗原，按Boster原位细胞增殖与凋亡检测试剂盒说明进行操作，Tris缓冲盐溶液冲洗2次，每次5min，然后DAB显色，流水冲洗，苏木精复染，盐酸酒精分化、脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察。光镜下见细胞核呈棕黄着色的为凋亡细胞，有黄褐着色的为增殖细胞。每张切片在光镜下（×200）随机选取3个视野，共约1500个瘤细胞，分别计算增殖细胞所占百分率和凋亡细胞指数A1。

1.3 统计学处理 实验结果数据应用SPSS软件包进行统计分析，用均值±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠肿瘤大小和盆腔淋巴结转移比较，见表1。

表1 治疗组与对照组膀胱肿瘤大小（mm2）及盆腔淋巴结转移率（%）比较

上表提示，治疗组5只裸鼠中无1只发生淋巴结转移，而对照组5只中有3只出现转移，转移率为60%，在肿瘤大小方面，治疗组与对照组相比较也存在明显差异。两组在肿瘤大小和转移率方面的比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体分别通过下调癌基因miRNA－21和上调抑癌基因（Tumstatin）水平来抑制膀胱癌细胞增殖并促进其凋亡，从而有效遏制膀胱癌生长转移。MTT法和TUNEL法检测结果分别显示，治疗组的细胞增殖率是41.30%，与对照组的94.7%相比较，P＜0.05，治疗组的细胞凋亡率指数为30.18，明显高于对照组的9.53，两者比较P＜0.05，比较两组间细胞增殖率和凋亡指数差异均有统计学意义（P＜0.05）。图1中细胞核呈黄褐色者代表增殖细胞，图2中细胞核呈棕黄色者为凋亡细胞。

图1 裸鼠移植瘤细胞增殖分析（MTT）×200

图2 裸鼠移植瘤细胞凋亡分析（TUNEL）×200

3 讨论

研究证实，肿瘤的发生发展和转移是由于癌基因和抑癌基因这一平衡体系被某种鲜为人知的因素所打破，使癌基因激活，抑癌基因失活，从而导致恶性肿瘤的发生［8］。本研究结果显示，治疗组肿瘤生长和淋巴结转移明显受到抑制，瘤细胞增殖率明显低于对照组，而凋亡指数则显著高于对照组，提示治疗后肿瘤细胞凋亡的增加可能是肿瘤生长缓慢的直接原因，而瘤细胞凋亡可能是癌基因水平下调，抑癌基因活性提高的继发性改变。

由于反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体具有同时抑制癌基因miRNA－21和上调抑癌基因Tumstatin的双重性特异作用，故其遏制裸鼠原位移植膀胱癌生长的作用明显优于单纯抗miRNA－21的作用。如果这一实验结果能在临床膀胱癌的治疗中得到证实，那么，以双位点为主导的基因靶向治疗可能将为膀胱癌的治疗提供一种新的更加确实有效的治疗方法。

另外，截止目前，虽然包括淋巴结清除在内的外科手术加化疗仍是膀胱癌的常规治疗模式，但是有些病例诊断后失去了手术机会，还有相当一部分病例手术后局部复发。大多数膀胱癌虽对化疗药物有一定的敏感性，然而化疗本身的毒副作用和在化疗过程中出现的耐药性仍是目前难以克服的治疗瓶颈。众多实验显示，膀胱癌的发生、生长、转移和预后均与遗传基因密切相关，抑制癌基因表达或上调抑癌基因水平能显著抑制肿瘤的生长及转移［9，10］。本实验试用反义 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒载体来遏制膀胱癌的发生发展，初步观察到治疗组肿瘤生长缓慢，且无一只发生淋巴转移，与对照组相比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。由此实验结果推测，如果把基因疗法与传统的手术和化疗有效联合，这可能比目前手术加化疗的传统治疗模式对膀胱癌病人更有帮助，尤其能大大提高丧失手术机会的膀胱癌病人的疗效。

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