TaqMan探针结合COLD－PCR原理定量检测JAK2V617F突变率研究

梁国威，邵冬华，曹清芸，王树琴，王新华，徐雪松

（1.航天中心医院 检验科，北京100049；2.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033）

2005年多个研究组同时发现JAK2V617F（JAK2蛋白酪氨酸激酶基因）第1849位点突变（G＞T）与骨髓增殖性疾病（MPDs）有关，该突变可明显导致真性红细胞增多症（PV）、特发性血小板增多症（ET）和骨髓纤维化（IMF）的发生和发展［1－5］。2008年世界卫生组织（WHO）将JAK2V617F突变纳入到上述疾病的诊断标准中［6］。由于JAK2 V617F是获得性造血干细胞突变，骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同细胞系的突变。Xu X［7］等报道在37例非MDPs诊断的JAK2V617F患者中，有25例JAK2V617F突变率小于5%，因此，对于JAK2V617F检测方法的敏感性，特别是少量突变克隆株的检测，显得尤为重要。

2008年，LI等［8］报道较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应（COLD－PCR）可显著提高少量突变的检出率。其中快速COLD－PCR适用于变性温度（Tc）值降低的突变，其原理是（1）任何一段DNA序列都有其严格、特定的Tc值，Tc值不同可致扩增效率产生巨大差异；（2）当PCR反应的Tc值设定在突变（如G：C＞A：T；G：C＞T：A等）DNA序列时，由于该Tc值低于野生型DNA片段，导致PCR扩增中野生型DNA片段的双链大部分不能完全打开，而该Tc值可使得突变型DNA片段大部分双链打开，由此即可实现对突变型DNA片段进行富集，然后进行分析。

由于JAK2V617F突变是G＞T点突变，适合快速COLD－PCR方法，因此，本研究采用TaqMan／MGB突变探针作为突变碱基的指示信号，结合快速COLD－PCR原理，建立高敏感性的在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F的突变率的Taq－Man－COLD－PCR方法。

1 材料与方法

1.1 纯合野生、纯合突变和外周血基因组DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP304－02），按试剂盒说明操作。提取的基因组DNA在－80℃冻存备用。其中纯合JAK2V617F突变细胞株（HEL，人红白细胞白血病细胞，购自中国科学院细胞库）经细胞培养至指数增长期后，提取基因组DNA；纯合野生（健康志愿者）和患者EDTA抗凝外周全血200μl用于基因组DNA提取。

1.2 质粒标准品的制备和基因组DNA浓度校准采用特异引物分别扩增纯合突变和纯合野生JAK2基因中第13外显子至第14－15间内含子共计1 818 bp，按常规方法构建JAK2V617F野生和突变质粒标准品，构建的质粒标准品经测序确认，并根据重组质粒分子量将质粒标准品换算并稀释成1×109～1×105拷贝数／ml。以质粒标准品作为实时荧光定量PCR检测标准曲线，将提取的HEL细胞株、健康志愿者和患者外周血基因组DNA的浓度校准为5.0×107拷贝数／ml。

1.3 JAK2V617F突变率标准品配制 将浓度为5.0×107拷贝数／ml的健康志愿者基因组DNA作为稀释基质，加入同等浓度的HEL细胞基因组DNA，进行浓度梯度稀释，配制成100%－0.1%的JAK2V617F突变标准品。

1.4 TaqMan－COLD－PCR引物和探针 上游引物：5′－TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA GC－3′；下游引物：5′－AGA AAG GCA TTA GAA AGC CTG TAG T－3′（由北京赛百盛基因技术有限公司合成）。TaqMan／MGB突变探针：与突变碱基匹配（其中下划线碱基是突变碱基），5′－FAM－TCC ACA GAA ACA TAC－MGBNFQ－3′；TaqMan／MGB通用探针：避开突变碱基，其与突变和野生皆可完全匹配，5′－VIC－ACA TAC TCC ATA ATT TA－MGBNFQ－3′，TaqMan／MGB探针由美国ABI公司合成。

1.5 检测仪器和反应体系构成 20μl反应体系，包括Taqman GT Master Mix 2×（购自美国ABI公司，目录号：4371355）10μl，探针1μl（终浓度0.25μM），上、下游引物各2μl（终浓度分别是0.2 μM），模板2μl（浓度5.0×107拷贝数／ml），水2 μl。其中，浓度校准和选择TaqMan－COLD－PCR 的Tc值时，采用TaqMan／MGB通用探针；检测JAK2 V617F突变率的标准曲线和标本检测采用Taq－Man／MGB突变探针。浓度校准仪器采用7500Real－Time PCR系统（美国ABI公司 ）；TaqMan－COLD－PCR Tc值的选择和检测方法建立采用Rotor－Gene Q real－time PCR分析系统 （美国QIAGEN公司）。

1.6 扩增条件 TaqMan－COLD－PCR Tc值的选择：（1）95℃，10min；（2）95℃－76℃，15s，62℃，40 s（读荧光值），50个循环，以确定最佳Tc值。JAK2 V617F突变率检测：（1）95℃，10min，（2）95℃，15 s；62℃，40s；8个循环，（3）79.0℃，15s；62℃，60s（读荧光值）；50个循环。

1.7 临床标本检测 共计9例患者，其中真性红细胞增多症患者（PV）8例，骨髓纤维化患者（IMF）1例，采用建立的 TaqMan－COLD－PCR方法检测JAK2V617F突变率，测序确认。

1.8 统计学方法 JAK2V617突变率与循环阈值（Ct值）间的相互关系和定标曲线的建立采用直线回归分析，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，以P＜0.05作为差别有显著性的标准。

2 结果

2.1 选择 TaqMan－COLD－PCR 的Tc值 分别以5.0×107拷贝数／ml浓度的人HEL细胞株和健康志愿者外周血基因组DNA作为模板，以TaqMan／MGB通用探针作为检测信号，逐渐降低变性温度，由95.0℃降至78.7℃。根据以下原则确定Taq－Man－COLD－PCR的Tc值：（1）突变和野生反应体系扩增曲线的Ct值差别最大；（2）突变反应体系的扩增效率最佳；最终确定TaqMan－COLD－PCR的Tc值是79.0℃，见图1。

2.2 TaqMan－COLD－PCR检测JAK2V617F突变率标准曲线的建立 将Tc值设定为79.0℃，将浓度5.0×107拷贝数／ml的含有100%、10%、1%和0.1%的JAK2V617突变的标准品同时重复测定2次。结果显示，检测突变率的下限是0.1%，JAK2突变率的对数值与Ct值间呈线性关系，线性回归分析显示：r＝0.993，P＜0.001，线性回归方程是：y＝－0.196x＋4.186。因此，根据测定的患者标本Ct值，通过回归方程计算即可获得该患者JAK2 V617F突变率，计算公式是：JAK2V617F突变率＝10（4.186－0.196×Ct值）。见图2。

图1 TaqMan－COLD－PCR选择Tc值的扩增曲线图

2.3 TaqMan－COLD－PCR方法检测患者标本结果

测定体系包括100%－0.1%突变率标准品和100%野生纯合标准品作为阴性对照，采用建立的TaqMan－COLD－PCR方法对9例患者标本进行检测，扩增曲线见图3。测定的9例患者中，真红8例，骨髓纤维化1例，8例真红中的6例患者JAK2 V617F突变率为18.5%－50.9%，2例真红和1例骨髓纤维化患者JAK2突变率为阴性。

图2 TaqMan－COLD－PCR检测JAK2V617F突变率PCR扩增曲线图和定标曲线图

图3 TaqMan－COLD－PCR测定9例患者标本扩增曲线图

2.4 患者标本测序结果

将9例患者标本通过常规PCR扩增后测序（扩增条件和引物同质粒标准品的制备），结果显示，TaqMan－COLD－PCR与测序结果全部符合。见图4。

3 讨论

本研究采用TaqMan／MGB探针作为检测信号，结合COLD－PCR扩增原理，成功建立了在外周血中定量检测JAK2V617F突变率的TaqMan－COLD－PCR方法，该方法通过测定患者外周血基因组DNA的Ct值，再根据突变率与Ct值的标准曲线回归方程，计算该测定标本中JAK2V617F的突变率。所建立 TaqMan－COLD－PCR 检测方法 可 对JAK2V617F突变率进行定量检测，并具有高突变检测敏感性、高通量检测、快速和无污染等特点，由于采用外周血标本进行检测，还具有操作简单的特点。

本研究建立的JAK2V617F突变率检测方法的检测下限是0.1%，明显优于其它JAK2V617F的检测方法。文献报道，DNA直接测序方法检测突变率的下限为20%［3］；等位基因特异PCR方法 敏感性为1%－3%［9］；荧光定量PCR－ARMS原理和溶解曲线方法的敏感性为1%［10，11］，限制性片段长度多态性 （RFLP）的敏感性为20% 左右［4］。由 于JAK2V617F已作为骨髓增殖性疾病重要的分子诊断标志物，提高该突变检测下限的敏感度将有助于临床对该类疾病的早期诊断。

图4 9例患者外周血基因组DNA中JAK2 V617F突变测序结果

COLD－PCR检测微量突变的原理是基于相同的DNA序列中野生和突变的变性温度不同所导致的扩增效率差异，对于G：C与T：A的突变导致Tc值仅存在1℃的差异［12］，本研究在 TaqMan－COLDPCR Tc值的选择中也观察到突变和野生间的扩增效率差异仅相差1℃（79.6℃－78.7℃），在既保证扩增效率又保证扩增效率差异的条件下，每0.1℃的变性温度改变都对实验有明显影响，因此，选择高精度温控的PCR扩增仪非常重要，PCR分析仪升温达到Tc值的温度过冲和孔间温差是影响本实验精确度和重复性的关键因素。

由于JAK2V617F是获得性造血干细胞突变，因此骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同细胞系的突变。在外周血中，除粒系外，其它细胞系的基因组DNA 中皆不携带JAK2V617F突变［1，2，4］，因此，采用外周血基因组DNA检测JAK2V617F突变率不能达到100%。本研究通过建立的TaqMan－COLD－PCR方法测定了9例患者外周血中JAK2V617F突变情况，其中6例阳性患者的JAK2V617F突变率为18.5%－50.9%，除外淋巴细胞基因组后，6例患者外周血中JAK2V617F突变率是26.2%－62.3%。

采用紫外分光光度计进行基因组DNA浓度校准，通过Real－time PCR定量检测时，其拷贝数／ml并不相同，因此本研究首先对所有的基因组DNA中JAK2基因拷贝数／ml的浓度进行校准，然后再进行JAK2V617F突变率标准曲线的建立和患者标本检测。通过对基因组DNA进行拷贝数／ml的浓度校准，使得本研究中JAK2V617F突变率的检测更为准确。

综上所述，本研究建立的TaqMan－COLD－PCR方法，以外周血基因组DNA作为检测标本，可对JAK2V617F突变率进行定量检测，突变率检测下限为0.1%，该方法在一个反应体系内即可完成检测，具有操作简单、高通量检测标本、重复性好、检测报告时间短等特点。由于JAK2V617F突变已作为骨髓增殖性疾病的分子诊断标志物，该方法将明显提高骨髓增殖性疾病的诊断灵敏度，并有助于上述疾病治疗过程中治疗效果的监测。

［1］James C，Ugo V，Le Couedic JP，et al.A unique clonal JAK2mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera［J］.Nature，2005，434（7037）：1144.

［2］Kralovics R，Passamonti F，Buser AS，et al.A gain－of－function mutation of JAK2in myeloproliferative disorders［J］.N Engl J Med，2005，352（17）：1779.

［3］Levine RL，Wadleigh M，Cools J，et al.Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2in polycythemia vera，essential thrombocythemia，and myeloid metaplasia with myelofibrosis［J］.Cancer Cell，2005，7（4）：387.

［4］Baxter EJ，Scott LM，Campbell PJ，et al.Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2in human myeloproliferative disorders［J］.Lancet，2005，365（9464）：1054.

［5］Zhao R，Xing S，Li Z，et al.Identification of an acquired JAK2mutation in polycythemia vera［J］.J Biol Chem，2005，280（24）：22788.

［6］Tefferi A，Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms：the 2008World Health Organization criteria and point－of－care diagnostic algorithms［J］.Leukemia，2008，22：14.

［7］Xu X，Zhang Q，Luo J，et al.JAK2（V617F）：Prevalence in a large Chinese hospital population［J］.Blood，2007，109（1）：339.

［8］Li J，Wang L，Mamon H，et al.Replacing PCR with COLD－PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing［J］.Nat Med，2008，14（5）：579.

［9］Jones AV，Kreil S，Zoi K，et al.Widespread occurrence of the JAK2V617Fmutation in chronic myeloproliferative disorders［J］.Blood，2005，106（6）：2162.

［10］James C，Delhommeau F，Marzac C，et al.Detection of JAK2 V617Fas a first intention diagnostic test for erythrocytosis［J］.Leukemia，2006，20（2）：350.

［11］McClure R，Mai M，Lasho T.Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2V617Fmutation in chronic myeloproliferative disorders［J］.Leukemia，2006，20（1）：168.

［12］Liew M，Pryor R，Palais R，et al.Genotyping of single－nucleotide polymorphisms by high－resolution melting of small amplicons［J］.Clin Chem，2004，50（7）：1156.