黄鳝ERα cDNA的克隆与序列分析

廖 凯，杨代勤，阮国良，孟 冉，袁汉文

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

黄鳝ERα cDNA的克隆与序列分析

廖 凯，杨代勤，阮国良，孟 冉，袁汉文

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

运用RT-PCR和5’RACE技术获得黄鳝(Monopterusalbus)ERα cDNA,长度为1989bp,其开放阅读框(ORF)包含1518个碱基序列，共编码506个氨基酸。5’UTR长度为152bp，获得的3’UTR长度为319bp。蛋白质序列同源性分析显示，黄鳝ERα与鲈形目鱼类ERα相似性较高，与舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)、大口黑鲈(Micropterussalmoides)、石斑鱼(Epinepheluscoioides)、金头鲷(Sparusaurata)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)和底鳉(Fundulusheteroclitus)相似性分别为74.9%、73.5%、68.8%、68.2%、66.8%和65.6%。蛋白质序列分析发现，黄鳝ERα 175～257和308～456个氨基酸分别为雌激素受体超家族功能域DBD和LBD。进化树分析显示，黄鳝ERα和其他鱼类ERα聚为一支。

黄鳝(Monopterusalbus)；ERα；克隆；序列分析

雌激素(estrogen)是具有广泛生理功能的性类固醇激素，它在调节生长发育、繁殖和各种疾病发生中起着重要作用。雌激素的各种生理功能通过雌激素受体(estrogen receptors，ERs)介导来实现。哺乳动物ERs存在2种亚型，ERα和ERβ，它们是位于不同染色体上的不同基因编码的产物。由于基因组复制事件的发生，硬骨鱼类ERs种类比哺乳动物更为复杂，目前发现ERβ在大多数硬骨鱼类中存在异型体(ERβ1和ERβ2)，同时ERα异型体(ERα1和ERα2)在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[1]和倒刺鲃(Spinibarbusdenticulatus)[2]等鱼类中已有报道。ERs作为核受体超家族一员，主要通过与核内雌激素反应元件(estrogen response elements，EREs)结合而调控靶基因的转录。

雌激素在性腺发育、性别分化和繁殖中起着关键作用。在鱼类中，ERs在精巢和卵巢有着广泛的表达[3-6]，这表明ERs在鱼类繁殖和性腺发育中起着重要作用。对鱼类ERs基因的研究将有助于理解雌激素在鱼类繁殖中的生理功能及其作用机制。目前，已有10余种鱼类ERα cDNA报道，如尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[3]、奥利亚罗非鱼(Oreochromisaureus)[4]、金鱼(Carassiusauratus)[5]、日本鳗鲡(Anguillajaponica)[7]、斑点叉尾鮰 (Ictaluruspunctatus)[8]、斑马鱼(Daniorerio)[9]、金头鲷(Sparusauratus)[10]、大西洋绒须石首鱼(Micropogoniasundulatus)[11]、舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)[12]、大西洋鲑(Salmosalar)[13]、石斑鱼(Epinepheluscoioides)[6]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[14]、倒刺鲃(Spinibarbusdenticulatus)[2]等。黄鳝(Monopterusalbus)作为我国重要的淡水名特水产养殖鱼类，规模化养殖受到苗种资源短缺的制约，其特殊的繁殖生物学特性(性逆转)是黄鳝苗种人工繁殖的主要困难之一。已有研究[15-16]表明，外源性雌激素可以延缓黄鳝性逆转。克隆黄鳝ERα基因可为理解雌激素在黄鳝性逆转中的作用打下基础，为黄鳝人工繁殖提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

用于RNA提取的黄鳝来自长江大学黄鳝研究所，体重约95g，无伤病。RNA提取试剂盒、T载体及PCR试剂购自Takara公司。反转录试剂盒购自Fermentas公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为Omega公司产品。大肠杆菌 (Escherichiacoli) DH5α购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。5’RACE试剂盒由Clontech公司生产。其他试剂为国产分析纯。

1.2 黄鳝RNA的提取及反转录

取黄鳝卵巢组织，用RNA提取试剂盒提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。然后参照Fermentas公司的ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit方法合成cDNA。

1.3 引物设计

根据NCBI上黄鳝ERα部分片段序列(登录号：AY686635.1)设计特异性引物，根据真金鲷(Chrysophrysmajor)(登录号：AB007453.1)、加州鲈(Micropterussalmoides)(登录号：AF253062.2)、金头鲷(登录号：AJ006039.1)、石斑鱼(登录号：GU721076.1)、黑棘鲷(Acanthopagrusschlegelii)(登录号：AY074780.1)的ERα序列设计同源引物。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物设计软件采用Primer5.0。引物序列及用途见表 1。

表1 扩增黄鳝ERα cDNA序列所用引物

1.4 黄鳝ERα序列的扩增

1.4.1 ERα5’cDNA的扩增

按照BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit说明书方法合成5’RACE cDNA模板，用特异性引物(5’-RACE-R1和5’-RACE-R2)与BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 5’RACE引物(UPM)进行半巢式PCR扩增。PCR反应体系：模板cDNA 1μl，10×buffer 2.5μl，10mmol/L dNTPs 0.5μl，上、下游引物(10mol/L)各1μl,Tap DNA聚合酶1U，加双蒸水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min；然后进行30个循环，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。PCR产物纯化后连接到PMD18-T载体，连接产物转化至感受态细胞DH5α，用氨苄抗性筛选后送至上海生工生物测序。

1.4.2 ERα下游编码区扩增

以DNA为模板，以特异性引物ERα3F和同源引物ERα3R为引物，扩增ERα下游编码区。反应条件为：94℃预变性4min；然后进行30个循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。其他处理同1.4.1。

1.5 黄鳝ERα序列分析

开放阅读框(ORFs)分析及蛋白质一级结构预测在ORF finder server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)上进行。使用Meg 4.0软件中的clustal W 方法对黄鳝ERα基因编码的氨基酸进行进化树的构建，靴值重复设置为1000，用于评价进化树的可靠性。氨基酸序列同源性分析使用DNAStar软件MegAlign功能进行。

2 结果与分析

2. 1 黄鳝ERα序列及推导氨基酸序列

运用RT-PCR和5’RACE获得黄鳝ERα cDNA，长度为1989bp，其开放阅读框(open reading fragment，ORF)包含1518个碱基序列，共编码506个氨基酸。5’UTR长度为152bp，获得的3’UTR长度为319bp。蛋白质序列分析发现，黄鳝ERα 的175～257和308～456个氨基酸分别为雌激素受体超家族功能域DBD(DNA binding domain)和LBD(Ligand binding domain)(图 1)。

下划线示起始密码子和终止密码子；方框示黄鳝ERα保守功能域DBD；灰色阴影部分示黄鳝ERα保守功能域LBD

2. 2 黄鳝ERα进化树

利用NCBI上其他鱼类ERs和黄鳝ERα，采用MEGA4.0构建进化树，结果如图2。从图2可以看出，鱼类ERs分为ERα和ERβ 2个大支，ERβ1和ERβ2分别聚为2束，共同组成ERβ一支，ERα另成一支，黄鳝ERα与其他鱼类ERα在一起。

图2 ER s cDNA编码的氨基酸序列构建的系统进化树

黑体加粗字体显示为黄鳝。用于构建进化树的ERs蛋白GenBank登录号为：斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)(ERα：ADK90033.1，ERβ1：ADK90034.1，ERβ2：ADK90035.1)；人(Homosapiens)(ERα：spP11474.3，ERβ：NP_004443.3)；斑马鱼(Daniorerio)(ERα：AAK16740.1，ERβ1：AAK16742.1，ERβ2：CAC93849.1)；金鱼(Carassiusauratus)(ERα1：AAL12298.1，ERα2：AAR17610.1，ERβ1：AAD26921.1，ERβ2：AAF35170.1)；虹鳟(Oncorhynchusmykiss)(ERα1：P16058.3，ERα2：ABA60432.1，ERβ1：ABA60433.1，ERβ2：ABB73309.1)；尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)(ERα：Q9YH33.1，ERβ1：Q9YH32.1，ERβ2：ABE73151.1)；奥利亚罗非鱼(Oreochromisaureus)(ERα：CAA63774.1，ERβ1：ACF75102.1，ERβ2：ACF75103.1)；底鳉(Fundulusheteroclitus)(ERα：AAT72914.1，ERβ1：AAU44352.1，ERβ2：AAU44353.1)；大口黑鲈(Micropterussalmoides)；(ERα：AAG44622.2，ERβ1：AAO39210.1，ERβ2：AAO39211.1)；大西洋绒须石首鱼(Micropogoniasundulatus)(ERα：AAG16713.1，ERβ1：AAG16711.1，ERβ2：AAG16712.1)；舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)(ERα：CAD43599.1，ERβ1：CAD33851.1，ERβ2：CAD33852.1)；金头鲷(Sparusaurata)(ERα：CAB51479.1，ERβ1：AAD31033.1，ERβ2：CAE30470.1)；黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)(ERα：AAL82743.1，ERβ1：AAL82742.1，ERβ2：ABY60988.1)。

3 讨论

本研究克隆了黄鳝雌激素受体α(ERα)亚型整个阅读框和5’非翻译区(UTR)。蛋白质序列同源性分析表明，黄鳝ERα与鲈形目ERα相似性较高，与舌齿鲈、大口黑鲈、石斑鱼、金头鲷、尼罗罗非鱼和底鳉相似性分别为74.9%、73.5%、68.8%、68.2%、66.8%和65.6%，与鲤科鱼类ERα相似性为50%～60%之间，与人ERα相似性仅30.3%。

雌激素受体(ERs)作为核受体超家族成员之一，通过DBD结构域与目的基因上游调控序列结合而调节目的基因的转录。DBD由2个含有4 Cys残基的锌指结构组成[17]。LBD 是ERs家族另一个重要的功能域，雌激素通过与LBD结合从而激活ERs介导的一系列基因转录调控反应[18]。DBD和LBD具有很强保守性[19]。蛋白质序列分析表明，黄鳝ERα具有DBD和LBD2个重要功能域。

高等脊椎动物只存在2种类型ERs，鱼类ERs比高等脊椎动物更为复杂，存在多种亚型。目前以确定鱼类具有ERβ1、ERβ2和ERα3种类型，虽然在NCBI网站上能找到金鱼和虹鳟ERα2序列，鱼类ERs氨基酸进化树表明，金鱼、虹鳟ERα2与其他鱼类ERα聚为一支，鱼类是否存在ERα2还有待于进一步验证。鱼类ERs各种类型在繁殖中的功能目前还不清楚，已有研究[2,6,9,11-12]表明，鱼类ERβ1、ERβ2和ERα在繁殖轴中有着不同的表达谱和生理功能。黄鳝作为我国重要的淡水名特水产养殖品种，其繁殖生理值得研究。本研究克隆了黄鳝ERα cDNA序列并对其结构进行了分析，下一步将对黄鳝ERα在繁殖中的生理功能进行研究。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.07.010

Q781；Q959.482

A

1673-1409(2012)07-S036-06

2012-07-02

公益性行业(农业)科研专项(NO.201003076)。

廖 凯(1987-)，男，湖北咸丰人，硕士生，研究方向为鱼类繁殖生理。

杨代勤，E-mail：yangdaiq@163.com。