RP-HPLC法测定三皮止癣酊中蛇床子素的含量

邹渭洪，付成效，龙宇，刘琪（.南华大学附属第一医院药剂科，湖南衡阳400；.南华大学附属第二医院药剂科，湖南衡阳 400；.衡阳市中医院药剂科，湖南衡阳 400）

RP-HPLC法测定三皮止癣酊中蛇床子素的含量

邹渭洪1＊，付成效1，龙宇2，刘琪3（1.南华大学附属第一医院药剂科，湖南衡阳421001；2.南华大学附属第二医院药剂科，湖南衡阳 421001；3.衡阳市中医院药剂科，湖南衡阳 421001）

目的：建立测定三皮止癣酊中蛇床子素含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-水（76∶24，V/V），流速为1.0mL·min－1，检测波长为322nm，柱温为25℃。结果：蛇床子素进样量在0.0384～0.7680µg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.9996）；平均加样回收率为100.45%，RSD＝1.88%（n＝6）。结论：本方法操作简便、快速、准确，适用于三皮止癣酊中蛇床子素的含量测定。

三皮止癣酊；反相高效液相色谱法；蛇床子素；含量测定

三皮止癣酊是由蛇床子、土荆皮、紫荆皮、苦樟根皮等中药组方制成的制剂，具有清热燥湿、杀虫止痒之功效，临床上用于治疗股癣、湿疹等症。方中蛇床子为君药，所含主要有效成分蛇床子素[1，2]具有抗变态反应、增强免疫力的作用。其现行质量标准中只有常规检查与薄层鉴别项，无定量控制指标。因此，笔者采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对三皮止癣酊中蛇床子素的含量测定方法进行了研究，为该制剂的质量控制提供定量检测方法。

1 仪器与试药

HP1100型HPLC仪，含HP1100色谱工作站、VWD紫外检测器（美国惠普公司）；TG328A型万分之一光学读数分析天平（南京东吴分析仪器有限公司）；超声波清洗器（北京医用设备厂）；HH-W型三用恒温水浴锅（上海印溪仪器仪表有限公司）。

蛇床子素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：110822-200305）；三皮止癣酊（衡阳市中医院制剂室提供，批号：20110520、20110614、20110728，规格：100mL/瓶）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司）；水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（76∶24，V/V）；流速：1.0mL·min－1；检测波长：322nm；柱温：25℃；灵敏度：2AUFS；进样量：10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取蛇床子素对照品12.0mg，置25mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得480μg·mL－1的对照品贮备液；精密量取该贮备液1mL，置25mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（19.2μg·mL－1）。

2.2.2 供试品溶液 精密吸取本品10mL置锥形瓶中，蒸干，残渣加入25mL乙酸乙酯，称重，超声处理（功率：200W，频率：40kHz）30min，放冷，再称重，用乙酸乙酯补足失重，摇匀，滤过，取续滤液5mL，蒸干，残渣加入适量无水乙醇溶解、转移至10mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方量并以相同工艺制备缺蛇床子药材的阴性样品，照“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

在选定的色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液与供试品溶液各10µL，注入HPLC仪测定。结果，蛇床子素峰与样品中其他组分峰可达基线分离，且与相邻峰的分离度均＞1.5；理论板数按蛇床子素峰计算应≥5000；阴性对照在与蛇床子素对照品色谱峰相应位置处无干扰峰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.蛇床子素对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.蛇床子素Fig 1HPLC chromatogramsA.osthole control；B.test sample；C.negative control；1.osthole

2.4 线性关系考察

取蛇床子素对照品贮备液适量，加入无水乙醇依次稀释成质量浓度为3.84、9.60、19.20、28.80、38.40、76.80μg·mL－1的系列对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC仪，测定峰面积积分值。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝2.971×103X+52.562（r＝0.9996，n＝6）。结果表明，蛇床子素进样量在0.0384～0.7680µg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液10μL，重复进样6次，测定峰面积积分值。结果，RSD＝1.01%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10μL，于0、2、4、8、12、24、48h进样测定，记录峰面积积分值。结果，RSD＝1.35%（n＝7），表明供试品溶液在配制后48h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批（批号：20110520）样品适量，共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样测定，计算蛇床子素的含量。结果，RSD＝1.08%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密吸取已知含量（0.1027mg·mL－1）的样品10mL，共6份，分别加入一定量的蛇床子素对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述方法测定样品含量并计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样测定，计算样品中蛇床子素的含量，结果见表2。

3 讨论

在供试品溶液的制备过程中，先将样品直接用无水乙醇稀释至一定浓度后进样，色谱图上基线不平稳，蛇床子素峰有干扰，出现肩峰；即使通过改变流动相比例，也未能有效分离。考虑到该制剂药味组成较多，且酊剂以乙醇为溶媒，含有成分复杂，故根据蛇床子素在乙酸乙酯中溶解性好的特点，先将样品蒸干，再用乙酸乙酯超声提取，这样就除去了一部分水溶性杂质和干扰成分，色谱图上基线不会出现抬高飘移的现象，蛇床子素出峰良好。

本试验考察了乙酸乙酯超声提取15、30、45min对蛇床子素含量测定的影响。结果表明，样品在超声提取30min时已基本提取完全，因此采用超声法提取30min。

参照《中国药典》[3]和有关文献[4～8]对流动相进行考察，发现不需加入酸液或缓冲液即可获得良好的色谱峰；因甲醇相对乙腈毒性较小，价格也低廉，故选择甲醇-水（76∶24，V/V）作为本试验流动相。

综上，本方法操作简便、快速、准确，适用于三皮止癣酊中蛇床子素的含量测定。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Recovery of recovery tests（n＝6）

表2 三皮止癣酊中蛇床子素的含量测定结果（n＝3）Tab 2Content determination of osthole in Sanpi zhixuan tincture（n＝3）

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Content Determination of Osthole in Sanpi Zhixuan Tincture by RP-HPLC

ZOU Wei-hong，FU Cheng-xiao（Dept.of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hunan Hengyang 421001，China）
LONG Yu（Dept.of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hunan Hengyang 421001，China）
LIU Qi（Dept.of Pharmacy，Hengyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hunan Hengyang 421001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of osthole in Sanpi zhixuan tincture.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（76∶24，V/V）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 322nm and column temperature was 25℃.RESULTS：The linear range of osthole was 0.0384～0.7680µg（r＝0.9996）with an average recovery of 100.45%（RSD＝1.88%，n＝6）.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate and suitable for the content determination of osthole in Sanpi zhixuan tincture.

Sanpi zhixuan tincture；RP-HPLC；Osthole；Content determination

R283.662；R927.2

A

1001-0408（2012）47-4484-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.47.26

＊副主任药师。研究方向：临床药学与中药质量控制。电话：0734-8279115。E-mail：nhfyzwh@163.com

2012-08-30

2012-10-30）