HPLC-UV法测定大鼠脑组织中5-羟色胺含量

张远冬 张有金 郭延垒 刘学庆 于超

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)亦称血清素(Serotonin)，是人体内重要的神经递质，其参与睡眠、摄食、体温、学习、记忆等多种生理过程［1］。中枢神经系统5-HT含量异常与重性抑郁障碍(major depressive disorder，MDD)和自杀行为有着极其重要的联系［2，3］，同时也可以影响血脑屏障通透性的改变［4］。因此定量测定5-HT在脑组织中的含量对精神情感性疾病、脑血管疾病等的发病机制的研究具有重要参考价值。

据有关文献报道，5-HT含量测定的方法有生物法、免疫法［5，6］、荧光分光光度法［7］、高效液相-电化学色谱法(HPLCECD)、高效液相-荧光色谱法(HPLC-FLD)、高效液相-紫外色谱法(HPLC-UV)等［8］。目前，在大多数实验研究中都采用准确、高效、简便快速的液相色谱法，其中，HPLC-UV法以其仪器成本较低、操作简单、维护简便，因而在实验室中应用较为广泛，使用频率大大高于HPLC-ECD和HPLC-FLD。此外，HPLC-UV法常用于血清中5-HT含量的测定，但对于大鼠脑组织中5-HT含量的测定鲜有报道，因此本实验采用HPLC-UV法，建立了快速稳定、准确可靠的测定大鼠脑组织中5-HT含量的方法，为5-HT等相关神经递质类疾病的临床研究提供重要参考方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪(SHIMADZU LC-2010AHT);Z233MK型高速冷冻离心机(德国HEMNLE公司);3240025组织匀浆机(德国IKA公司);XS-105十万分之一精密电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);SB-3200DT超声波清洗机(宁波新芝公司);SEVEN Multi PH计(瑞士METTLER TOLEDO公司);Elix10超纯水净化系统(美国MILLIPOER公司);01730微孔过滤器(美国MILLIPORE公司)。

盐酸-5-羟色胺(Serotonin hydrochloride，美国 SIGMAALORICH公司，批号:H9523-25MG);甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为超纯水，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 色谱条件 色谱柱为SHIMADZU VP-ODS C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.01 mol/L的醋酸钾缓冲液(10:90，V/V，用0.2 mol/L柠檬酸调pH至4.00)等度洗脱，柱温:25℃，流速:1.00 ml/min，检测波长:275 nm。

1.3 标准品溶液的配制 精密称取5-HT标准品1.480 mg于容量瓶中，加超纯水溶解并定容，制成1 mg/ml的标准品贮备液，避光，-20℃冷藏保存。按实际检测需要稀释到相应的浓度，供检测用。

1.4 样品来源及制备 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠5只，每只平均体重为200±20 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格许可证号为SCXK(渝):2007-0002。

大鼠断头处死后取整个脑组织，称湿重，以1∶15加入PBS(1 mol/L磷酸氢二钾:1 mol/L磷酸二氢钾=80:20混合)，于冰浴中充分匀浆后混匀。为选择合适的蛋白沉淀剂，将匀浆液分为三份，分别加入匀浆液体积一半量的乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸沉淀蛋白。充分涡旋后，在4℃下以12000 rpm离心15 min后精密吸取上清液200 μl，用10 mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0，过0.45 μm滤膜后于 -80℃保存待测

2 结果

2.1 专属性考察 为确定流动相的最适pH值，分别考察了醋酸钾缓冲液pH值在5.00、4.50、4.00时的色谱峰峰形及峰高，结果如图1所示，pH在5.00和4.50时，峰形较宽，且有严重拖尾，当pH为4.00时，峰型良好，拖尾得到了良好的改善，因此确定缓冲液pH为4.00，与甲醇比例为90:10(V/V)进行等度洗脱，结果如图2所示，5-HT峰形良好，且无内源性物质干扰，其保留时间为9.3 min。

2.2 线性范围与最低检测限 精密量取5-HT标准品储存液各20 μl，分别加入超纯水稀释，配成浓度为 0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的标准溶液。在此色谱条件下进样测定，以面积A为纵坐标(Y)，以浓度C(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程为 A =46008.89C +1886.58(r=0.9999)，表明5-HT 在0.1 ～20 μg/ml范围内线性关系良好，适合于5-HT含量的测定;5-HT的最低检测限(LOD)为40 ng/ml(S/N＞3)。

2.3 精密度实验 精密吸取5-HT标准品溶液各20 μl，分别加超纯水稀释，制成高、中、低三种浓度为7.5、1.5、0.15 μg/ml的标准溶液200 μl，于第1 d各测定5次，每次进样20 μl，计算当日内峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察日内精密度;同时连续测定3 d，计算3 d内峰面积RSD，考察日间精密度。结果如表1所示，各浓度的日内、日间RSD均小于3%;表明此实验方法精密度良好。

2.4 稳定性考察 精密量取5-HT标准品溶液各20 μl，制成高、中、低3 种浓度为7.5、1.5、0.15 μg/ml的标准溶液800 μl，平行制备两组，一组置于室温保存，另一组置于-20℃保存，并于第1、2、3、5、7天连续进样，每日各测定5 次，记录峰面积，带入标准曲线求得测定浓度，计算一周内所测浓度的RSD，考察5-HT的稳定性。结果如表2及表3所示，室温和冻融实验下5-HT各浓度RSD均小于3%;说明5-HT在室温和冻融试验中均较稳定，易于保存。

2.5 加样回收率考察 精密吸取未经蛋白沉淀处理的大鼠脑组织匀浆液3份，再精密加入特定体积的标准品溶液，制成含标准品浓度分别为0.19、0.16、0.13 μg/ml的待测液溶液各200 μl，每一浓度平行制备3组，每组重复测定5次，考察其加样回收率。按公式:回收率=(测定液测定值-原样液含测值)/加入量值×100%，计算大鼠脑组织中5-HT加样回收率。结果如表4所示，所测得范围为89.62% ～101.6%，符合生物样品测定要求，说明此色谱条件下所测得的5-HT含量准确度较好。

图1 不同pH值下的5-HT色谱图

图2 5-HT色谱图

表1 日内、日间精密度考察结果(n=5)

表2 室温稳定性(n=5)

表3 冻融稳定性(n=5)

表4 5-HT加样回收率(n=5)

2.6 样品含量的测定 取大鼠脑组织样品，按“1.4”项下方法操作，平行制备3组，并在此色谱条件下进行测定，照外标法计算，测得该组织样品中5-HT含量为(0.2715±28)μg/g。

3 讨论

在以往研究中，5-HT的含量测定方法众多，其中，免疫法实验条件要求高;荧光分光光度法操作复杂，数据读取时误差大，故其应用均受到较大限制;HPLC-ECD、HPLC-FLD、HPLC-UV法现已是国内外测定5-HT较为常用的方法。前二者虽然灵敏度高，但HPLC-ECD法测定时，仪器系统在分析前对样品进行钝化要求高［9］，电化学工作电极容易受污染且其样品极易受其他物质干扰，需严格控制测定过程来减少干扰［10］;同时其流动相组成常含有高浓度离子对试剂，对柱子伤害较大。而在HPLC-FLD法中，同样由于检测器成本昂贵，大大限制了其使用。本实验采用HPLC-UV法，建立了稳定快速的大鼠脑组织中5-HT的含量测定方法，测定结果准确可靠，适用于临床和科研对5-HT大样本量的检测。

本实验在参考文献［11］的基础上，对检测方法进行了流动相比例、pH值、离子强度等的优化。结果发现5-HT色谱峰在流动相为4.00时峰形良好，且无内源性物质的干扰;在流动相的配制上，选用10 mmol/L的醋酸钾溶液，并以0.20 mol/L的柠檬酸调节pH至4.00的方法，降低了缓冲盐离子强度，减小了缓冲盐体系对柱子的损伤程度。

在样品制备过程中，本文进行了蛋白沉淀试剂的优化，比较了乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸的蛋白沉淀效果。发现乙腈和10%的三氟乙酸沉淀蛋白时均出现严重的干扰峰，而10%的高氯酸沉淀时无蛋白峰干扰，且5-HT色谱峰峰形良好。由于高氯酸有很强的氧化性，对柱子损害较大，因此进样前需调节样品溶液pH值至7.0左右，以降低其对分析柱的损伤。

［1］林凌云，李慧，许崇涛，等.HPLC-荧光法测定大鼠脑组织中的单胺类神经递制质及相关物质.华西药学杂志，2007，22(5):557-558.

［2］Rodrigo A，Espana，Thomas E，et al.Sleep Neurobiology from a Clinical Perspective.SLEEP，2011，34(7):845-858.

［3］Neves FS，Malloy-Diniz LF，Romano-Silva MA，et al.Is the serotonin transporter polymorphism(5-HTTLPR)a potential marker for suicidal behavior in bipolar disorder patients.J Affect Disorders，2010，125(1-3):98-102.

［4］Kemaldo P，de Vries Elisabeth GE，Muskiet FA，et al.Clinical chemistry of serotonin and metabolites.J Chromatogr B:Biomed Sci Appl，2000，747(1-2):33-48.

［5］黄建国，陆世华，王晓春.酶免试验法测定全血5-羟色胺.临夏医学杂志，2002，24(9):545-546.

［6］李建刚，张巧俊，高敬龙，等.脑卒中后抑郁患者5-羟色胺含量的研究.中国临床神经科学，2007，15(2):129-132.

［7］张秀明，顾仁俊，张中兴，等.荧光分光光度法测定血清5-羟色胺的实验研究及临床应用.陕西医学检验，2009，9(1):14-16.

［8］鲁燕侠，崔佳蔺，兴谣，等.RP-HPLC-荧光检测法测定小鼠脑组织中5种神经递质的含量.解放军药学学报，2003，19(4):262.

［9］谭炳炎，郑琳，冯翔.高效液相色谱/电化学法测定大鼠血液和脑组织中单胺类物质的含量.分析测试学报，2006，25(2):90-92.

［10］张向晖，刘军，苏林雁.库仑阵列电化学高效液相色谱法测定大鼠脑组织中单胺类神经递质及代谢产物.医学临床研究，2007，24(1):1-3.

［11］Brazelll MP，Marsden CA，Nisbet AP，et al.The 5-HT 1 receptor agonist RU-24969 decreases 5-hydroxytryptamine(5-HT)release and metabolism in the rat frontal cortex in vitro and in vivo.Br J Pharmacol，1985，86(1):209-216.