新型含偕二甲基结构的PAR-1拮抗剂的合成及其抗血小板聚集活性

张林山， 苗华明， 张海良，谭初兵， 周植星， 邵 华， 李 明， 赵桂龙1,

(1. 山东轻工业学院 化学与制药工程学院，山东 济南 250353； 2. 天津药物研究院 药物设计与发现天津市重点实验室，天津 300193； 3. 青岛科技大学 化学与分子工程学院，山东 青岛 266042)

抗血小板药物是一类重要的抗凝血类药物，广泛应用于动脉血栓性疾病的治疗，如急性冠脉综合症。研究表明，血小板可以被一系列激动剂激活，如凝血酶，ADP，血栓烷A，胶原蛋白和肾上腺素等，其中凝血酶是最强的激动剂[1]。凝血酶受体拮抗剂是一类很有潜力的抗凝血药物,主要通过位于血小板表面的蛋白酶激活受体1(PAR-1)发挥作用。PAR-1也叫凝血酶受体，目前有两个化合物(SCH530348[2,3]和E5555[4,5])处于临床试验阶段。

本课题组[6，7]在研究PAR-1拮抗剂的过程中，以E5555为模板，设计、合成了一个含偕二甲基的PAR-1拮抗剂2(Chart 1)[7]。为了进一步研究2的构效关系，本文以1-(5-叔丁基-4-羟基-3-溴苯基)乙酮(3)和3，3-二甲基-5，6-二乙氧基-二氢异吲哚1-亚胺(8)为主要原料，设计并合成了3个新型的含有偕二甲基结构的PAR-1拮抗剂——1-(3-叔丁基-4-烷氧基-5-取代氨基苯基)-2-(5,6-二乙氧基-3,3-二甲基-1,3-二氢-1-亚胺基-2H-异吲哚-2-基)乙酮氢溴酸盐(2a～2c， Scheme 1)，其结构经1H NMR和13C NMR表征。并研究了2a～2c对TRAP诱导的人血小板聚集活性的抑制作用。

Chart1

CompabcREtn-Prn-PrXOOCH2

Scheme1

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

X-4型数字显微熔点仪(温度未校正)；Bruker AV 400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS内标)；Thermo Nicolet Avtar FT 370型红外光谱仪(KBr压片)；Agilent Q-TOF 6510型高分辨质谱仪(ESI)。

3[4～6]和8[7]按文献方法制备；其余所用试剂均为分析纯或化学纯，其中THF和DME(1,2-二甲氧基乙烷)用金属钠干燥，二苯甲酮作指示剂蒸馏纯化；DMF用CaH2干燥后减压蒸馏纯化。

1.2 合成

(1) 4-烷氧基-3-溴-5-叔丁基苯乙酮(4a和4b)的合成

在干燥的反应瓶中加入3 5.42 g(20 mmol)， EtBr(Ⅰa)或n-PrBr(Ⅰb)50 mmol， 固体K2CO35.53 g，固体KI 1.66 g及DMF 50 mL，搅拌下于室温反应过夜(TLC监测)。倒入冰水(300 mL)中，用浓盐酸小心调至pH 4～5，用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并萃取相，用饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋蒸除溶后经硅胶柱层析[梯度洗脱剂：A=V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶50～1 ∶20]纯化得4a和4b。

4a： 无色油状液体，收率94%；1H NMRδ: 8.06(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.86(d,J=2.4 Hz, 1H), 4.11(q,J=6.9 Hz, 2H), 2.55(s, 3H), 1.42(t,J=7.0 Hz, 3H), 1.37(s, 9H)。

4b： 无色油状液体，收率96%；1H NMRδ: 8.06(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.86(d,J=2.4 Hz, 1H), 4.03(t,J=6.6 Hz, 2H), 1.83～1.88(m, 2H), 1.37(s, 9H), 1.04(t,J=7.4 Hz, 3H)。

(2) 4-烷氧基-3-溴-5-叔丁基苯乙酮二甲基缩酮(5a和5b)的合成

在反应瓶中加入4a或4b18 mmol，原甲酸三甲酯[HC(OMe)3]6.37 g(60 mmol)，樟脑磺酸[(±)-CSA]0.42 g(1.8 mmol)和甲醇15 mL，搅拌下于室温反应过夜(TLC监测)。加入固体K2CO30.41 g(3 mmol)，于室温反应至pH>7。抽滤，滤液倒冷却的饱和食盐水入(200 mL)中，迅速用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋蒸除溶，真空干燥得5a或5b(未经纯化直接用于下步反应)。

5a： 无色油状液体，收率91%；1H NMRδ: 7.46(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.33(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.04(q,J=6.9 Hz, 2H), 3.06(s, 6H), 1.42(s, 3H), 1.38(t,J=7.0 Hz, 3H), 1.34(s, 9H)。

5b： 无色油状液体，收率90%；1H NMRδ: 7.46(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.33(d,J=2.4 Hz, 1H), 3.96(t,J=6.6 Hz, 2H), 3.06(s, 6H), 1.79～1.85(m, 2H), 1.42(s, 3H), 1.34(s, 9H), 1.02(t,J=7.4 Hz, 3H)。

(3) 4-烷氧基-3-取代氨基-5-叔丁基苯乙酮二甲基缩酮(6a～6c)的合成(以6a为例)

在干燥的反应瓶中依次加入5a16 mmol，吗啉(Ⅱa)20 mmol，叔丁醇钠1.92 g(20 mmol)，Pd(OAc)20.22 g(1 mmol)， 2,2′-双(二苯基膦基)-1,1′-联萘(BINAP)0.62 g(1 mmol)及DME 30 mL，氮气气氛中回流反应过夜(TLC监测)。冷却至室温，抽滤，滤液倒入冷却的饱和食盐水中，迅速用二氯甲烷(3×50 mL)萃取,合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋蒸除溶后经中性氧化铝柱层析(梯度洗脱剂：A=1 ∶100～1 ∶30)纯化得6a。

用类似的方法合成6b和6c。

6a： 无色棱柱状晶体，收率85%， m.p.78 ℃～80 ℃；1H NMRδ: 7.02(d,J=1.6 Hz, 1H), 6.90(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.22(q,J=7.1 Hz, 2H), 3.74～3.76(m, 4H), 3.06(s, 6H), 2.95(s, 4H), 1.42(s, 3H), 1.31～1.33(m, 12H)。

6b： 无色棱柱状晶体，收率80%， m.p.90 ℃～91 ℃；1H NMRδ: 7.02(d,J=2.0 Hz, 1H), 6.90(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.6 Hz, 2H), 3.73～3.75(m, 4H), 3.05(s, 6H), 2.93(s, 4H), 1.72～1.78(m, 2H), 1.41(s, 3H), 1.32(s, 9H), 1.02(t,J=7.4 Hz, 3H)。

6c： 白色固体，收率77%， m.p.91 ℃～92 ℃；1H NMRδ: 6.99(d,J=2.0 Hz, 1H), 6.92(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.8 Hz, 2H), 3.05(s, 6H), 2.87(s, 3H), 1.73～1.79(m, 2H), 1.64～1.66(m, 4H), 1.50～1.51 (m, 2H), 1.40(s, 3H), 1.32(s, 9H), 1.02(t,J=7.4 Hz, 3H)。

(4) 4-烷氧基-α-溴-3-取代氨基-5-叔丁基苯乙酮(7a～7c)的合成(以7a为例)

在干燥的反应瓶中依次加入6a12 mmol， THF 40 mL及甲醇10 mL，搅拌下于7 ℃加入苯基三甲基三溴化铵4.89 g(13 mmol)，反应1 h(TLC监测)。滴加Na2S2O3·5H2O 0.27 g(1.1 mmol)的水(10 mL)溶液，滴毕，于室温反应1 h。倒入冷却的饱和食盐水中，用二氯甲烷(3×50 mL)萃取,合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋蒸除溶，于室温放置固化，用混合溶剂(A=1 ∶30)溶解，反应过夜。抽滤，滤饼于室温真空干燥得7a。

用类似的方法合成7b和7c。

7a： 白色固体，收率91%， m.p.149 ℃～150 ℃；1H NMRδ: 7.62(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.49(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.89(s, 2H), 4.29(q,J=7.1 Hz, 2H), 3.76～3.78(m, 4H), 2.98～3.00(m, 4H), 1.33～1.36(m, 12H)。

7b： 白色固体，收率93%， m.p.111 ℃～112 ℃；1H NMRδ: 7.62(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.50(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.89(s, 2H), 4.21(t,J=6.6 Hz, 2H), 3.76～3.78(m, 4H), 2.98(s, 4H), 1.76～1.81(m, 2H), 1.36(s, 9H), 1.03(t,J=7.4 Hz, 3H)。

7c： 无色油状物，收率87%；1H NMRδ: 7.59(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.50(d,J=2.0 Hz, 1H), 4.87(s, 2H), 4.21(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.92(s, 4H), 1.74～1.81(m, 2H), 1.66～1.69(m, 4H), 1.52～1.53(m, 2H), 1.35(s, 9H), 1.03(t,J=7.4 Hz, 3H)。

(5)2a～2c的合成(以2a)为例

在干燥的反应瓶中加入7a10 mmol， 8 2.48 g(10 mmol)及THF 30 mL，搅拌下于室温反应过夜(TLC监测)。过滤，滤饼用少量THF洗涤，于室温真空干燥得2a。

用类似的方法合成2b和2c。

2a： 白色固体，收率94%， m.p.218 ℃～219 ℃；1H NMRδ: 9.49(bs, 1H， NH), 8.94(bs, 1H， NH), 7.79(s, 1H， ArH), 7.69(d,J=1.6 Hz, 1H， ArH), 7.57(d,J=1.6 Hz, 1H， ArH), 7.42(s, 1H， ArH), 5.37(s, 2H， CH2CO), 4.31(q,J=6.9 Hz, 2H， CH2CH3), 4.19(q,J=6.9 Hz, 2H， CH2CH3), 4.10(q,J=6.9 Hz, 2H， CH2CH3), 3.79～3.80(m, 4H， NCH2), 3.04(m, 4H， OCH2), 1.47(s, 6H， CCH3), 1.36～1.40(m, 18H， CH3);13C NMRδ: 190.37, 160.79, 155.42, 153.73, 148.66, 146.61, 145.35, 143.38, 129.01, 121.47, 117.52, 116.56, 106.44, 105.59, 70.23, 66.39, 65.01, 64.53, 64.29, 50.24, 48.06, 34.92, 30.21, 23.70, 15.11, 14.47, 14.38; IRν: 3 354, 3 222, 3 038, 1 694, 1 671, 1 602, 1 494, 1361 cm-1; HR-ESI-MS： Calcd for C32H45N3O5{[M+H]+} 552.343 7, found 552.341 1。

2b： 白色固体，收率91%， m.p.228 ℃～229 ℃；1H NMRδ: 9.51(bs, 1H， NH), 9.06(bs, 1H， NH), 7.84(s, 1H， ArH), 7.69(d,J=1.2 Hz, 1H， ArH), 7.59(d,J=1.2 Hz, 1H， ArH), 7.43(s, 1H， ArH), 5.39(s, 2H， CH2CO), 4.16～4.25(m, 4H， CH2), 4.10(q,J=6.9 Hz, 2H， CH2CH3), 3.81(s, 4H， NCH2), 3.03(s, 4H， OCH2), 1.75～1.85(m, 2H， CH2CH2CH3), 1.48(s, 6H， CCH3), 1.33～1.40(m, 15H， CH3), 1.06(t,J=7.4 Hz, 3H， CH2CH3);13C NMRδ: 190.41, 160.82, 155.54, 153.67, 148.61, 146.58, 145.27, 143.26, 128.99, 121.56, 117.69, 116.61, 106.72, 105.60, 70.57, 70.23, 66.36, 64.53, 64.31, 50.30, 48.16, 34.90, 30.15, 23.71, 22.76, 14.45, 14.36, 10.50。

2c： 白色固体，收率88%， m.p.216 ℃～217 ℃；1H NMRδ: 9.51(bs, 1H， NH), 8.93(bs, 1H， NH), 7.81(s, 1H， ArH), 7.66(d,J=2.0 Hz, 1H， ArH), 7.59(d,J=1.6 Hz, 1H， ArH), 7.42(s, 1H， ArH), 5.37(s, 2H， CH2CO), 4.16～4.25(m, 4H， NCH2), 4.10(q,J=7.1 Hz, 2H， OCH2CH3), 2.97(s, 4H， CH2), 1.77～1.84(m, 2H， CH2), 1.70～1.71(m, 4H， CH2), 1.55(s, 2H， CH2), 1.47(s, 6H， CCH3), 1.35～1.41(m, 15H， CH3), 1.06(t,J=7.4 Hz, 3H， CH2CH3);13C NMRδ: 190.36, 160.84, 160.78, 155.88, 153.70, 148.63, 146.59, 143.05, 128.82, 121.27, 118.18, 116.58, 106.58, 105.57, 89.28, 70.51, 70.23, 64.52, 64.24, 51.31, 48.04, 34.88, 30.16, 25.94, 23.77, 23.69, 22.83, 14.45, 14.37, 10.47。

1.3 2a～2c的抗血小板聚集活性测试

采用两周未服用药物的健康志愿者血样20 mL，与3.8%枸橼酸钠按9/1(体积比)混合抗凝，于室温离心10 min，吸出上层富含血小板血浆(PRP)进行血小板聚集实验。

取300 μL PRP置比浊管内，分别加入3 μL待测化合物(c=10 μg·mL-1，以0.1%DMSO生理盐水为溶剂)或等体积空白对照液，于37 ℃温育5 min。加入血小板聚集诱导剂TRAP，用LBY-NJ四通道血小板聚集仪测定对照管和给药管PRP在10 min内的最大聚集率。加入的血小板聚集诱导剂终浓度分别为：凝血酶0.5 U·L-1， TRAP 10 μmol·L-1。数据以均数±标准差(M±SD)表示，按公式计算抑制率{抑制率=[聚集率对照管-聚集率给药管)/聚集率对照管]×100%}。

2 结果与讨论

2．1 合成

在KI作催化剂和K2CO3存在下，3分别使用EtBr和n-PrBr在DMF于室温反应顺利烷基化得到烷基醚4a～4b； 4在CSA存在下用原甲酸三甲酯在甲醇中室温下处理，转化为对应的二甲基缩酮5a～5b； 5在Buchwald-Hartwig反应条件下分别与吗啉和哌啶反应，形成C-N得到烷基芳胺6a～6c； 6在THF/MeOH中于7 ℃经过苯基三甲基三溴化铵处理，分子中的二甲基缩酮基团被除去同时羰基α-位被溴化得7a～7c； 7与含有偕二甲基的环状脒8[7]在THF中室温下反应合成了3个新型的含偕二甲基结构的PAR-1拮抗剂2a～2c。

2．2 2a～2c的抗血小板聚集活性

2a～2c的抗血小板聚集活性结果见表1。由表1可见，阳性对照品E5555表现出极强的抗血小板聚集的活性，抑制率为(98.79±32.04)%，而2a～2c只表现出一定的活性，其中2b和2c的抑制率较2a低。

表12a～2c的抗血小板聚集活性*

Table1Anti-platelet aggregation activities of2a～2c

Comp2a2b2cE5555抑制率/%44.45±4.3326.04±2.1023.45±3.4898.79±32.04

*c=10 μg·mL-1; Mean±SD, n=8; E5555按文献[6]方法制备

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