鸡腿菇单孢分离和单孢杂交的研究

张树强，卫彩红，胡建伟

（1.塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；3.塔里木大学食用菌研究所，新疆 阿拉尔 843300）

发展鸡腿菇生产，选育优良的鸡腿菇菌种是个关键的问题之一。含有某一遗传因子的孢子在单孢培养的条件下，可以充分表现其潜在的特性而显示出较大的变异，从而通过单孢菌株的杂交、杂交菌株的筛选可望选育出优良的新菌株[1,2]。以野生鸡腿菇和鸡腿菇特白36为亲本进行研究，利用单孢分离和单孢杂交选育鸡腿菇杂交品种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

野生鸡腿菇由阿拉尔地区采集；鸡腿菇特白36引自江苏高邮食用菌研究所。

1.1.2 供试培养基PDA培养基

葡萄糖20 g、马铃薯200 g、琼脂15 g、水1 000 mL，pH自然。

1.1.3 实验材料预备

超净工作台，显微镜，PDA培养基倒平板待用，棉兰染色液、无菌水、75%酒精、三角瓶、无菌棉球、解剖针、解剖刀、镊子、棉塞、标签纸，所有材料物品均需做无菌处理。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡腿菇孢子收集

取长至八分熟尚未开伞的的鸡腿菇菌株子实体，每菌种各取2个。用解剖刀去除菌盖表层的鳞片和菌柄部分的泥土，酒精棉球擦拭表层做初次消毒，然后用无菌水进行冲洗数次待用。孢子收集在超净工作台中进行，要求在酒精灯火焰上方进行操作。用灭过菌的解剖刀将菌盖从中间切开，露出菌褶。然后用解剖针挑取小块菌褶贴在无菌三角瓶的壁上，用棉塞密封。菌褶取菌盖与菌柄连接处为好。将做好的三角瓶放于冰箱中保存，待用时取出加入无菌水约10 mL，由于鸡腿菇孢子液化的特性，所以溶解震荡即可获得孢子悬浮液[3]。

1.2.2 单孢分离及单核菌丝

（1）单孢分离

孢子分离工作在超净工作台中进行，取出含有鸡腿菇菌褶的三角瓶，用注射器吸取10 mL无菌水注入并震荡，得到孢子悬浮液。在试管架上分两排各摆放10支灭过菌的空试管，用注射器吸取9 mL无菌水再吸取1 mL孢子悬浮液摇匀，注入第1支试管9 mL即得到10－1的悬浮液。然后把剩有1 mL悬浮液的注射器再次吸入9 mL无菌水摇匀，注入第2支试管9 mL即得到10－2的悬浮液。依次类推分别获的 10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8 的孢子悬浮液。取最后3种稀释倍数的悬浮液，用滴管取1滴到载玻片，经棉兰染色液染色，置于低倍显微镜下观察，以毛细管所吸的菌液大多数每滴为l粒孢子为宜，将该稀释倍数的悬浮液进行涂布平板[4]。

（2）单核菌丝鉴定

待平板的菌落长到2 cm时，用灭过菌的解剖针挑取边缘菌丝置于载玻片上，经棉兰染色液染色，置于显微镜下观察，若无锁状联合可初步认为是单孢萌发而生成的单核菌丝，然后转接到斜面上培养。

1.2.3 杂交菌株的鉴定

挑取选出长势旺盛的单核体菌株菌丝，两两配对接种于平板培养基或斜面上，两者间距1.5 cm～2 cm，对峙适温培养。待两菌丝接触后，挑取100处交界处的部分菌丝作为杂交菌株进行刷选。

（1）镜检锁状联合

待两菌丝接触后，挑取交界处的部分菌丝用棉兰染色后进行镜检，如发现锁状联合，立即将其转接于新的斜面培养基上，于25℃下培养10 d左右，选出菌丝生长旺盛、菌落形态均匀的菌株，挑取少许菌丝放在显微镜下观察，鉴定确是双核菌丝后，则初步确定为杂交菌株。

（2）拮抗试验

拮抗试验是鉴定菌株间遗传差异的传统方法，菌丝之间的拮抗反应是菌株间不同菌株遗传特性的重要表现。将平板培养基划分为4格，顺时针方向依次划分为A、B、C、D区。A、C分别接种杂交菌株的菌丝体，B、D分别接种亲本的菌丝体，菌丝能互相长进去并连成一片的说明是同种菌丝，若在相交处形成明显的黄褐色拮抗线，便说明菌种性质不同[5，6]。

（3）液体培养基出菇试验

将所有的杂交组合分别接种于含有30 mL的液体培养基的三角瓶（100 mL）中，每个杂交组合3次重复。设置25℃下恒温培养，待菌丝长满液面温度降至18℃刺激菇蕾产生，记录菇蕾产生情况，淘汰不具备结实能力的杂交组合。

2 结果与分析

2.1 鸡腿菇孢子收集与单孢分离

采用该方法收集到的孢子污染率低，而且可随时制作孢子悬浮液进行试验，不需要每次试验都进行孢子收集。

2.2 单核菌丝鉴定

单核菌丝与双核菌丝的区别见表1。

表1 单核菌丝与双核菌丝的区别

从表1可以看出，试验各获得55个单核体菌株。经生长观察，去除菌丝长势慢、菌丝纤细、菌丝稀疏的菌株，分别选择35个长势旺盛的单核体配对杂交。

2.3 杂交菌株的鉴定

2.3.1 镜检锁状联合

在双核菌丝隔膜处形成的侧生特征性突起即为锁状联合，具备锁状联合的是双核菌丝，表明杂交亲和，经过染色镜检20个组合没有锁状联合，80个组合有锁状联合。

2.3.2 拮抗试验

杂交组合与亲本进行拮抗试验，23个组合与亲本菌丝相互交叉，即没有产生新的性状，属于同一菌丝，57个有拮抗线。

2.3.3 液体培养基出菇试验

杂交组合进行液体出菇试验，9个没有产生菇蕾，48个产生了菇蕾。最终确定获得了48个杂交新菌株。

3 小结与讨论

传统的孢子收集方法如钟罩法、钩悬法，污染率高，且需要对收集的孢子悬浮液进行无菌检查，确定无污染才可以继续试验，这就增加了试验步骤，延长了试验的时间，所以用三角瓶冷藏菌褶的方法更适合收集鸡腿菇的孢子收集。

单孢分离准备工作中，正确使用高温高压灭菌锅。灭菌要彻底，不带任何杂菌。试验中使用的平板，要无杂菌，厚度为2 mm～3 mm，平面要均匀。

在显微镜检查培养皿盖上的菌液时，应要求只有一个孢子的才能接入PDA培养基。

由于异宗结合的四极性菌类，通过单孢子培养菌丝之间进行杂交时，只有1/4交配型产生可孕的双核体。所以对试验中杂交菌种，需经镜检、提纯菌种，并做进一步的出耳试验，才能选择出优良的新品种应用到生产上。

[1]黄年来.中国食用菌百科[M].北京：中国农业出版社，1993.

[2]张健.鸡腿菇的特性与栽培[J].食用菌，2005(2)：35.

[3]郭美英.金针菇杂交育种研究[J].食用菌，1993，15(4)：4－6.

[4]陈文良.香菇新品种L934和L937的培育[J].华北农学报，1994，9(4)：111－115.

[5]谢芝芳.应用单孢分离技术选育双孢蘑菇、姬菇新品种[D].四川农业大学硕士学位论文，2005.

[6]肖美丽.糙皮侧耳单孢杂交优良菌株选育初步研究[D].华中农业大学硕士学位论，2008.