α2肾上腺素受体基因多态性与2型糖尿病患者伴无症状心肌缺血的关系

高 晶， 陈秋静， 张 彬， 陆 林， 张瑞岩， 张 奇， 胡 健， 杨震坤， 沈卫峰

(1.复旦大学附属妇产科医院检验科，上海200011;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科，上海200025)

无症状心肌缺血(silent myocardial ischemia，SMI)是指缺乏胸痛或与心肌缺血相关的主观症状情况下心肌缺血［1-2］，多见于糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者，其发生率为10%～30%［3］。因此，对患有冠心病(coronary artery disease，CAD)的糖尿病患者进行SMI筛查是十分必要的［4］。α2-肾上腺素受体(adrenergic receptor，AR)广泛分布于中枢和外周神经系统，共同参与调节交感系统的多种生理功能，并与心血管疾病发病和疼痛调节有关［5］。α2-AR有3种亚型，即α2AAR、α2B-AR 和α2C-AR［5］。α2A-AR、α2B-AR 和α2C-AR的基因依次定位于10、2和4号染色体上，已发现人类α2B-AR基因的插入(insertion，I)/缺失(deletion，D)多态性(3个谷氨酸残留物)(rs4066772)在受体第3细胞内环影响脱敏功能［6-7］。α2A-AR 启动子区域 C-1291G 多态性(rs1800544)及α2C-AR基因4个氨基酸缺失多态性(rs2234888)分别被报道与神经和心血管疾病相关［8-9］。然而，仍未被发现这些遗传变异与SMI的潜在关联，特别是在DM方面。

为此，我们对患有CAD的2型DM(type 2 diabetes mellitus，T2DM)伴 SMI患者和T2DM 伴心绞痛患者的α2A-AR、α2B-AR和α2C-AR基因多态性分布情况进行了分析。

材料和方法

一、研究人群

随机选取上海交通大学医学院附属瑞金医院体检中心107名无糖尿病及CAD、无正在使用营养补充剂或药物、肝肾功能和心电图正常者作为对照组，男72名，女35名，年龄51～85岁。选取上海交通大学医学院附属瑞金医院2005年1月至2006年2月心脏内科门诊及住院患者经血管造影证实患有CAD的T2DM患者321例，其中T2DM伴SMI患者129，男92例，女37例，年龄45～84岁;T2DM伴心绞痛患者192例，男124例，女68例，年龄44～89岁。

二、诊断标准

CAD诊断依据冠状动脉造影结果。冠状动脉管腔狭窄≥70%定义为CAD，冠状动脉左主干狭窄≥50%作为2支血管病变。129例T2DM伴SMI患者在24 h动态心电图检查中有瞬时的无症状ST段压低，为SMI组。192例T2DM伴心绞痛患者心电图检查符合心绞痛，并有心绞痛或心绞痛相关事件，归为心绞痛组。入选患者排除了急性心肌梗死、严重心力衰竭、需要透析治疗的肾功能衰竭、有严重危及生命的疾病或炎症患者。通过C-肽测定排除1型DM患者。本研究经医院伦理委员会批准，并获得了知情同意书。

三、方法

1.生化项目评估 采集禁食8 h以上的空腹血，分离血清并在-80℃冻存。测定血糖、血脂［包括总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、脂蛋白(a)、载脂蛋白A1(apo A1)、载脂蛋白B100(apo B100)］和肾功能［包括尿素(Urea)、肌酐(Cr)和尿酸(UA)］水平。仪器为美国贝克曼-库尔特公司全自动LX-20型生化分析仪，试剂为美国贝克曼-库尔特公司提供的原装试剂盒。

2.引物设计 应用引物设计软件(美国ABI公司)设计引物，见表1。

表1 引物设计

3.DNA提取 使用新鲜血液及DNA提取试剂盒(美国 Qiagen公司)来制备基因组DNA。DNA在使用前冻存于-80℃。

4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和基因分型 用PCR和限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)或测序的方法进行基因分型。PCR反应体系为50 μL，包括PCR 缓冲液、10 pmol引物、2.5单位 Taq DNA聚合酶(美国 Promega公司)和0.5μg模板 DNA。PCR 反应条件:94℃变性5 min、94 ℃变性 60s、退火 60s、72℃延伸 60 s，经35个循环，最后于72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，先用纯化试剂盒(美国Promega公司)进行纯化，再使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪(美国ABI公司)测序并进行多态性分析。

四、统计学分析

结 果

一、基线特征

正常对照组、SMI组和心绞痛组在年龄、性别方面无差异，SMI组和心绞痛组在年龄、性别、吸烟、血压、体重指数(body mass index，BMI)、血脂、肾功能、CAD严重程度及用药方面无差异，SMI组患者罹患T2DM的持续时间高于心绞痛组(P=0.003)，见表2。

二、多态性基因型分布与等位基因频率

SMI组和心绞痛组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。2组α2B-AR I/D基因多态性基因型分布与等位基因频率差异均有统计学意义(P值分别为0.008、0.037)。SMI组I/I基因型频率(34.9%)显著高于心绞痛组(19.8%，P=0.002)，见表3。2组α2A-AR C-1291G 与α2C-AR I/D多态性基因型分布及等位基因频率差异无统计学意义(P＞0.05)。正常对照组α2B-AR基因I/D多态性 D/D、I/D和I/I的基因型频率分别为15.0%、57.9% 及 27.1%，与SMI组和心绞痛组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)。α2A-AR(-1291C/G)多态性位点的RFLP图谱见图1。α2B-AR(I/D，301/301)PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图2。α2C-AR(I/D，325/322)DD型测序图见图3，α2C-AR(I/D，325/322)II型测序图见图4，α2C-AR(I/D，325/322)ID型测序图见图5。

表2 正常对照组、糖尿病伴SMI患者和心绞痛患者的比较

表3 多态性基因型分布和等位基因频率 ［例(%)］

图1 α2A-AR(-1291C/G)多态性位点的RFLP图谱

图2 α2B-AR(I/D，303/301)PCR产物琼脂糖凝胶电泳

三、多变量回归分析

用多变量Logistic回归分析评估DM患者发生SMI的独立危险因素，包括基因和心血管疾病危险因素。结果显示，罹患DM的持续时间和α2B-AR基因多态性的I/I基因型是T2DM患者发生SMI的独立危险因素，见表4。

表4 T2DM患者发生SMI的多变量Logistic回归分析

图3 α2C-AR(I/D，325/322)DD型测序图

图4 α2C-AR(I/D，325/322)II型测序图

图5 α2C-AR(I/D，325/322)ID型测序图

讨 论

DM患者有65%～80%死于冠状动脉疾病［10-11］。然而，DM患者SMI产生的机制仍然不明。由于神经病变是DM的主要并发症，本研究结果显示罹患DM的持续时间是发生SMI的独立危险因素。重要的是，本研究发现α2B-AR I/D多态性I/I基因型与DM患者发生SMI有关。对无症状CAD来说，这可能是一个新的遗传学危险因素的发现。

α2A-AR、α2B-AR和α2C-AR都有基因多态性。已有研究表明α2B-AR I/D基因多态性与心血管疾病有关，其中D/D基因型与CAD急性发作、院前致死性心肌梗死/心源性猝死以及高血压有关［12］。过表达α2B-AR的D多态性基因虽然不影响配体结合，但能降低G蛋白偶联受体激酶介导的磷酸化，造成短期促进激动剂脱敏功能完全丧失［7］。脱敏过程可调节细胞生理状态并应对环境的改变。这些发现表明α2B-AR基因D多态性在功能调节能力方面较I等位基因差。由此推测在α2-AR激动剂刺激下，I/I基因型可能更与镇痛作用相关。在DM状态下，由于交感神经的紧张度增加等因素，使疼痛的耐受力增加，这些过程可能加速了DM进展，并与遗传易感性共同导致DM患者SMI的发生。

α2A-AR和α2C-AR基因多态性与神经精神疾病和心血管疾病有关［8-9］。Leiphart等［13］在发生神经性疼痛的神经组织内发现这2种受体亚型的mRNA表达改变。动物实验表明α2A-AR、α2C-AR及α2B-AR同样和疼痛的感知和调节有关［14］。本研究结果显示α2A-AR和α2C-AR基因多态性频率在SMI和心绞痛患者之间差异无统计学意义。这需要更大样本量的研究来确认这些结果。

本研究也存在一些局限性。首先，目前研究中SMI的检测方法是不够的。从DM患者中筛选出SMI者的方法仍不明确。运动耐力测试、动态心电图记录、负荷超声心动图和计算机断层扫描冠状动脉钙化常常用来检测SMI，但心肌灌注显像似乎更加准确。其次，2组样本量相对较小，因此除α2B-AR基因多态性之外，其他基因型和等位基因频率的显著差异较难检出。再次，本研究中的SMI患者被定义为动态心电图过程中有瞬时无症状ST段压低的CAD患者［15］，而另一些研究则使用压力测试检查。因此，本研究可能会丢失部分在压力或严重劳累而非休息状态下发生SMI的患者。

综上所述，α2B-AR基因多态性I/I基因型与患有CAD的T2DM患者发生SMI有关。

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