2型糖尿病患者CR1基因多态性与红细胞CR1数量、黏附活性相关性研究

安 新，高利常，王冬梅，邹吉敏，李 超，袁宝军

(河北联合大学附属开滦医院检验科，河北 唐山 063000)

1型补体受体(complement receptor 1，CR1/CD35)是红细胞膜上主要的免疫物质，是红细胞有效清除免疫复合物(IC)的物质基础，参与许多疾病的发生及发展，从而成为国内外学者的研究热点[1-4]。2型糖尿病(T2DM)是一种慢性终身性疾病。近年来发现T2DM患者红细胞免疫功能低下，且与病程及并发症的发生、转归密切相关[5-7]。为进一步探讨T2DM与CR1基因多态性及红细胞CR1数量、黏附活性的关系及意义，我们对T2DM患者进行了研究。

材料和方法

一、临床资料

选择河北联合大学附属开滦医院临床确诊T2DM患者132例，均符合世界卫生组织(WHO)1997年诊断标准，其中男63例，女69例，年龄39～82岁。正常对照组124名，来自河北联合大学附属开滦医院健康体检者，其中男66名，女58名，年龄37～79岁。2组人群均排除心脑血管、血液系统、免疫系统和其他内分泌系统疾病，未曾接受改善免疫功能的治疗。

二、检测项目及方法

1.红细胞CR1黏附活性测定 (1)血样本处理:无菌采集所有对象清晨空腹外周血2 mL，枸橼酸钠抗凝，780×g离心，使红细胞沉淀备用;(2)靶细胞配置:37℃溶解已分装冰冻的靶细胞(肿瘤细胞)，加入1 mL生理盐水，混匀，2100×g离心5 min，吸净上清液(切勿吸掉细胞)，加入150 μL 生理盐水混匀，备用;(3)加样:取 1 μL 红细胞和100 μL血浆加入靶细胞管，混匀，37℃水浴30 min后加200 μL缓冲液，轻轻颠倒混匀;(4)结果判断和计数:取150 μL反应液置玻片中央，加一滴瑞姬氏染液并水平涂开，显微镜下计数100个靶细胞，结合5个以上红细胞的靶细胞为一个单位，计算“黏附率”，即黏附活性。试剂盒购自解放军302医院检验中心免疫室。

2.红细胞CR1分子定量测定 采用文献[8]的测定方法，试剂盒购自解放军302医院检验中心免疫室。

3.CR1基因多态性测定 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，限制性内切酶HindⅢ酶切位点位于结构基因内含子。参考文献[9]合成引物。引物 1:5'-CCT TCAATGGAATGGTGCAT-3';引物 2:5'-CCCTTG TAAGGCAAGTCTGG-3'。取待检者抗凝血0.1 mL，用碘化钠法提取模板DNA。PCR反应总体积30 μL，其中模板 DNA 3 μL、引物 1 和 2 各0.4 μL、TaqDNA 聚 合 酶 0.1 μL、4 × dNTP 2.4 μL、10 × PCR buffer 3 μL，加超纯水至30 μL，充分混匀后短暂离心。循环参数:94℃预变性4 min后，94 ℃ 60 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，扩增30个循环后，72℃延伸5 min。产物酶切:取扩增产物14 μL，加入内切酶 HindⅢ 6 μL并充分混匀，置于37℃水浴2 h。将酶切产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外观察。酶切后只出现1.8 kb 1条条带的为 HH 型(高表达型)，出现1.8、1.3和0.5 kb 3条条带的为HL型(中表达型)，出现1.3和0.5 kb 2条条带的为LL型(低表达型)，由此计算基因型频率和等位基因频率。试剂盒购于解放军302医院检验中心免疫室。

三、统计学方法

计量资料用t检验，计数资料用χ2检验，Ρ＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、T2DM组和正常对照组红细胞CR1数量及黏附活性变化

T2DM组红细胞CR1数量及黏附活性均低于正常对照组(Ρ ＜0.01)，见表1。

表1 T2DM组与正常对照组红细胞CR1数量及黏附活性比较()

表1 T2DM组与正常对照组红细胞CR1数量及黏附活性比较()

注:与正常对照组比较，*P＜0.01

组别 例数CR1数量(3×106 RBC)CR1黏附活性T2DM 组 132 1.21 ±0.49* 44.44 ±16.54*正常对照组124 1.84 ±0.52 53.82 ±17.93

二、T2DM组和正常对照组CR1基因多态性分布

T2DM组与正常对照组CR1基因型频率差异无统计学意义(χ2=1.824，Ρ ＞0.05);T2DM 组CR1等位基因L频率为14.8%，正常对照组等位基因L频率为11.3%，两者差异无统计学意义(χ2=1.3635，Ρ ＞0.05)。2 组3 种基因型频率见表2。

表2 T2DM组与正常对照组CR1基因多态性比较[例(%)]

三、T2DM组和正常对照组CR1基因不同基因型红细胞CR1数量及黏附活性分析

比较CR1基因HH、HL、LL 3种基因型的红细胞CR1数量与黏附活性。T2DM组和正常对照组组内比较，HH型红细胞CR1数量与黏附活性虽均高于 HL型，但差异无统计学意义(P＞0.05)。LL型因样本量小而未进行统计学处理。2组间同种基因型比较，T2DM组HH型、HL型红细胞CR1数量与黏附活性均低于正常对照组(Ρ＜0.05)。见表 3。

表3 T2DM组与正常对照组CR1基因不同基因型红细胞CR1数量及黏附活性分析()

表3 T2DM组与正常对照组CR1基因不同基因型红细胞CR1数量及黏附活性分析()

注:与T2DM组比较，*Ρ＜0.05;与T2DM组HL型比较，#Ρ＜0.05

组 别 例数CR1数量(3×106 RBC)CR1黏附活性T2DM 组6 1.54 ±0.44 47.12 ±15.09 HH 型 100 1.32 ±0.47 47.14 ±18.24 HL 型 25 1.12 ±0.54 41.19 ±16.36 LL 型 7 0.96 ±0.49 37.12 ±17.63对照组HH 型 102 1.91 ±0.60* 60.15 ±18.26*HL 型 16 1.79 ±0.53# 52.13 ±15.46#LL型

讨 论

人CR1是一种相对分子质量为160000～250000的单链膜糖蛋白，广泛分布于红细胞和白细胞等多种细胞，且绝大多数CR1呈簇状分布于红细胞。每个红细胞平均含有500个左右CR1，与年龄和性别无明显关系[10]。CR1是补体C3b的受体，是红细胞免疫功能的物质基础之一。研究证实，红细胞CR1有清除体内循环免疫物，调节细胞免疫和体液免疫等功能[10-11]。T2DM患者体内存在数量众多的循环免疫复合物(IC)，CR1数量及黏附活性变化与病程及并发症的发生、发展密切相关[5-7]。

CR1存在于红细胞、白细胞等多种细胞表面，但CR1基因多态性只在红细胞上表达，这是红细胞CR1与其他细胞CR1所不同之处[12]。人CR1为常染色体共显性遗传，该基因由2个复杂多样化的等位基因构成，位于1号染色体32区的补体激活调节子区[13-15]。根据长同源序列(LHR)转录本是4个还是5个LHR可分为CR1S和CR1F 2个等位基因。而决定红细胞CR1数量表达高低的是位于LHR-D的第2个短一致重复序列(SCR)27号内含子的点突变。由于该点突变，出现HindⅢ新酶切位点，表现为 CR1基因 HH、HL、LL 3种基因型。CR1等位基因正常为H型，突变后为L型。等位基因无HindⅢ新酶切位点，为HH型(纯合子)，酶切电泳只有1.8 kb片段;HL型(杂合子)有1个HindⅢ新酶切位点，可见1.8、1.3 和0.5 kb 3 个片段;LL 型(纯合子)有 2个HindⅢ新酶切位点，可见1.3和0.5 kb 2个片段。这种点突变主要由父母遗传，但也可后天获得[16-19]。

红细胞表面CR1数量与其黏附活性呈明显正相关[18]。红细胞CR1数量的变化主要由遗传因素即基因型决定。但在红细胞免疫功能过程，CR1因清除IC被消耗或封闭而造成数量有所下降[20]。本研究结果显示T2DM组和正常对照组CR1基因型频率HH型最高、HL型次之、LL型最低，T2DM组红细胞CR1等位基因L频率高于对照组，但T2DM患者CR1基因型频率和等位基因频率与正常对照组相比并无明显差异。而T2DM组红细胞CR1数量及黏附活性均低于正常对照组。提示T2DM患者红细胞CR1数量及黏附活性变化比CR1基因型频率变化更显著。故可将红细胞CR1数量及黏附活性变化作为T2DM研究的重要指标。

在2组组内对比中，CR1基因型频率无明显差异，红细胞CR1数量与黏附活性HH型与HL型无明显差异。提示T2DM患者红细胞免疫功能的改变与CR1基因型频率关系不密切。而组间同种基因型对比可见T2DM组HH型、HL型红细胞CR1数量与黏附活性均低于正常对照组(Ρ＜0.05)。提示T2DM患者红细胞免疫功能的改变与CR1基因的表达或后天获得性因素有关。虽然CR1基因在T2DM患者和健康人群分布一致，但在mRNA水平或蛋白质翻译阶段可能存在某种未知的调控机制，导致末端产物CR1分子表达水平降低，进一步影响红细胞免疫功能。或者T2DM患者处于高血糖水平，引起红细胞膜代谢改变，造成红细胞膜上CR1封闭或因清除IC被大量消耗而致CR1数量和黏附活性减低。本研究结果显示T2DM患者红细胞CR1数量及黏附活性减低，提示T2DM的发生与红细胞免疫功能低下有关。但T2DM的发生和CR1数量及黏附活性降低之间的因果关系还需进一步研究。

[1]Sinha S，Jha GN，Anand P，et al.CR1 levels and gene polymorphisms exhibit differential association with falciparum malaria in regions of varying disease endemicity[J].Hum Immunol，2009，70(4):244-250.

[2]岳展依.结肠癌患者红细胞CR1基因多态性的临床研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20(12):3281-3282.

[3]Boiocchi C，Zorzetto M，Sbarsi I，et al.CR1 genotype and haplotype involvement in coronary artery disease:the pivotal role of hypertension and dyslipidemia[J].Int J Mol Med，2009，24(2):181-187.

[4]Wakabayashi M，Ohi H，Tamano M，et al.Acquired loss of erythrocyte complement receptor type 1 in patients with diabetic nephropathy undergoing hemodi-alysis[J].Nephron Exp Nephrol，2006，104(3):e89-e95.

[5]Ruuska PE，Ikäheimo I，Silvennoinen-Kassinen S，et al.Normal C3b receptor(CR1)genomic polymorphism in patients with insulin-dependent diabetes mellitus(IDDM):is the low erythrocyte CR1 expre ssion an acquired phenomenon[J].Clin Exp Immunol，1992，89(1):18-21.

[6]Noorchashm H，Moore DJ，Lieu YK，et al.Contribution of the innate immune system to autoimmune diabetes:a role for the CR1/CR2 complement receptors[J].Cell Immunol，1999，195(1):75-79.

[7]卢大雷.Ⅱ型糖尿病患者红细胞天然免疫功能变化与CR1密度基因多态性的相关分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2003，23(5):332-334.

[8]王海滨，张景萍，沈 茜.红细胞补体受体1型分子定量测定法[J].中华检验医学杂志，1999，22(6):342-343.

[9]Cornillet P，Philbert F，Kazatchkine MD，et al.Genomic determination of the CR1(CD35)density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindⅢrestriction enzyme digestion[J].J Immunol Methods，1991，136(2):193-197.

[10]Rochowiak A，Niemir ZI.The structure and role of CR1 complement receptor in physiology[J].Pol Merkur Lekarski，2010，28(163):79-83.

[11]Boackle SA.Complement and autoimmunity[J].Biomed Pharmacother，2003，57(7):269-273.

[12]Katyal M，Tiwari SC，Kumar A，et al.Association of complement receptor 1(CR1，CD35，C3b/C4b receptor)density polymorphism with glomerulonephritis in Indian subjects[J].Mol Immunol，2004，40(18):1325-1332.

[13]Buraczynska M，Ksiazek P，Wacinski P，et al.Complement receptor 1 gene polymorphism and cardiovascular disease in dialyzed end-stage renal disease patients[J].Hum Immunol，2010，71(9):878-882.

[14]Krych-Goldberg M，Atkinson JP.Structure-function relationships of complement receptor type 1[J].Immunol Rev，2001，180:112-122.

[15]Carroll MC，Holers VM.Innate autoimmunity[J].Adv Immunol，2005，86:137-157.

[16]Liu D，Niu ZX.The structure，genetic polymorphisms，expression and biological functions of complement receptor type 1(CR1/CD35)[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2009，31(4):524-535.

[17]Rout R，Dhanqadamajhi G，Mohapatra BN，et al.High CR1 level and related polymorphic variants are associated with cerebral malaria in eastern-India[J].Infect Genet Evol，2011，11(1):139-144.

[18]Wong WW，Cahill JM，Rosen MD，et al.Structure of the human CR1 gene.Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele[J].J Exp Med，1989，169(3):847-863.

[19]Krych-Goldberg M，Moulds JM，Atkinson JP.Human complement receptor type1(CR1)binds to a major malarial adhesin[J].Trends Mol Med，2002，8(11):531-537.

[20]Senbagavalli P，Geetha ST，Karunakaran K，et al.Reduced erythrocyte CR1 levels in patients with pulmonary tuberculosis is an acquired phenomenon[J].Clin Immunol，2008，128(1):109-115.