棉花柱头可授性测定方法的研究

张香桂，倪万潮，沈新莲，徐 鹏

（江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏 南京210014）

棉花是常异花授粉作物，利用杂种优势是提高产量和改善品质的重要途径。中国是世界产棉国中种植杂交棉最多的国家之一，近年来我国转基因抗虫杂交棉花在生产上快速发展，尤以育苗移栽的长江流域棉区发展迅速。目前，江苏省80%以上的棉田种植杂交棉，其中多为转基因抗虫杂交棉，其杂交种子主要采用人工制种技术生产。随着劳动力成本的迅速提高，较高的种子生产成本已成为我国进一步发展转基因抗虫杂交棉的“瓶颈”，而其中用工最多的环节则是人工去雄。若不去雄直接授粉，棉花杂交种子的成本将显著降低。利用棉花高柱头材料或人为诱导棉花高柱头，用于棉花杂交制种则可以实现不去雄直接授粉[1，2]，但杂交种子纯度往往难以保证。能否采用提前授粉法解决杂交种子的纯度问题？所谓提前授粉，就是在棉花自花散粉前已完成授粉甚至受精过程，在生产上就是在开花前的一天或当日早上花苞尚未开放散粉前的时段。而此时段授粉棉花柱头是否有活性，花粉如何收集与保存，制种效率如何？对棉花花粉贮藏和当日花、隔日花（开花后第2天的花）柱头活力强弱的变化已有报道[3～5]，而对棉花次日花（第2天开放的花）柱头是否已成熟，能否接受正常的花粉而结实，则少见报道。同时，在对棉花花粉活性和柱头活性测定方法上的研究上，对花粉活力的测定方法报道较多，常用的有联苯胺-甲耐酚染色法、FDA荧光染色法、液体培养基培养发芽法、花柱基部花粉管穿透计数法和醋酸洋红反应法等，而对棉花柱头活性的测定多采用田间分时段授粉法[3～5]，费工费时，受花粉活性和外界环境因素影响大。本文借鉴其他作物柱头可授性检测方法，即用联苯胺—过氧化氢法测定棉花柱头的可授性，同时在田间进行授粉验证，以期探索棉花柱头活性快速测定方法，为棉花杂交育种和探索新的棉花高效制种技术提供参考。现将研究结果总结如下：

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 棉花品种：试验选用陆地棉常规高产品种（1）苏棉 9 号、（2）苏棉 19 号；抗虫棉品种（1）33B、（2）中植棉 3 号；彩色棉（1）棕絮品系 CP3、（2）绿絮品系 CP4；高品质棉品系（1）1176、（2）1196。

1.1.2 试验地点：试验于2010年在江苏省溧水植物科学基地进行。

1.2 试验方法

1.2.1 棉花柱头活性测定方法：采用联苯胺—过氧化氢法。联苯胺—过氧化氢反应液为1%联苯胺溶液、3%过氧化氢溶液、水的体积比为4:11:22的混合液，装入棕色瓶内，放在4℃冰箱保存备用。试剂配制：1%联苯胺溶液：称1 g联苯胺固体溶于100 mL50%的酒精，装入棕色瓶内备用；3%过氧化氢溶液：取10 mL30%的过氧化氢和90 mL蒸馏水混合，装入棕色瓶内备用；水：蒸馏水若干。

1.2.2 花粉活性测定方法：采用液体培养基花粉培养法，培养基配方由南京农业大学唐灿明教授提供，培养温度26℃～28℃。培养方法：在载玻片上滴2滴培养液，取3个花药放在培养液中,轻柔出花粉，将花药踢出，加上盖玻片，放在预先备好的放有少量加水卫生纸的培养皿中，培养3 h左右，在显微镜下即可观察到花粉管的萌芽和伸长情况，顺着一个方向记数，计算百分数。

2 结果与分析

用联苯胺—过氧化氢法测定棉花柱头活性，我们试用了三种操作方法，试验结果如下：

2.1 第一种操作方法的步骤和测定结果

借用张志良等（2004）的方法，在上午10:00之前，取8个棉花品种的当日花、次日花柱头各3个，分别放入凹面载玻片中 （即重复3次），用移液枪滴加联苯胺—过氧化氢反应液二三滴。观察其反应，均是切口处有气泡产生，其他部位很少产生气泡，柱头颜色变化不明显。此法不易区分棉花柱头的活性。

2.2 第二种操作方法的步骤和测定结果

在上午10:00之前，取8个棉花品种的当日花、次日花柱头各3个，将整个待测的柱头切为3段放入凹面载玻片中，其他操作同上。观察其反应，待测柱头均产生较多的气泡，且伤口处均变蓝色。此法不能区分棉花柱头的活性。

2.3 第三种操作方法的步骤和测定结果

在上午10:00之前，取8个棉花品种的当日花、次日花柱头，在离心管上标记，各3个重复。然后依次将柱头取下，柱头的顶端朝向离心管底部放入离心管内，用移液枪加入联苯胺—过氧化氢反应液，直至反应液淹没全部柱头，盖上离心管的盖子，观察结果如表1。

表1 棉花柱头活性测定结果

从表1测定的结果看，（1）不同品种的次日花柱头颜色变化不明显，气泡产生也较少，彩色棉的柱头几乎看不到变色。说明不管是什么品种的次日花的柱头活性都较差；（2）在当日花即当日完全开放花柱头颜色变化中，抗虫品种颜色变化快且染色深，高产棉和高品质棉品种柱头1 h后方可染上色，而彩色棉柱头颜色变化不及其他品种明显；而柱头产生的气泡（不是伤口处）不同品种完全开放花产生的都较多，而且能够维持较长的时间。说明不管是什么品种的当日花的柱头活性都较高。

2.4 田间授粉结果

在室内测定柱头活性的同时，田间分不同时段进行授粉，所使用的母本品种为苏棉9号，父本品种为33B。次日花授粉的花粉为上午取粉，存放在自己设计的授粉器中放入冰箱保存，使用时取出田间授粉，同时取少量测定花粉活性。花粉活性测定采用 “液体培养基花粉培养法”，以免因花粉活性差而影响试验结果。次日花授粉的，边去雄边授粉，授粉后套管隔离；当日花授粉的花朵，在前一天人工去雄，去雄后套管隔离，每处理授粉50朵花，授粉后套管隔离。调查成铃和结籽情况，结果如表2。

由表2可以看出，人工去雄后早上6：10授粉，花粉贮藏20 h以上，测定所使用的花粉活性在50%以上，但成铃率极低，仅为8%，是花粉活性不足还是柱头可授性影响，有待进一步试验。从15：40到19：00不同时段提前授粉，成铃率在40%～56%，且随着时间的推移成铃率有逐渐提高的趋势，但单铃健籽数都很少，最高仅在10.00个/铃。提前授粉单铃健籽数少，与室内棉花柱头活性测定结果相一致，即柱头尚未达生理成熟可能是其主要原因。

表2 田间授粉成铃情况调查结果

3 讨论

在棉花杂交育种和利用杂种优势大量生产棉花杂交种子的过程中，提高杂交成铃率和单铃健籽数具有重要的现实意义。棉花杂交结实率的高低决定于花粉的活性和柱头的可授性。研究棉花花粉活性的保存方法和柱头可授性的变化，可为提高制种工效及探索新的制种途径提供技术参考。

（1）本研究采用联苯胺一过氧化氢反应液漫过柱头法测定棉花柱头的活性，表现为活性高的柱头，整个柱头变蓝黑色且充满气泡，并能保持较长时间；无活性柱头产生气泡少且柱头始终不变色。在观察颜色变化时，要注意柱头和剪下柱头的伤口处的不同，伤口处变色并不能代表是柱头变色，不能用来证明柱头具有可授性。此法可较清晰地区分棉花柱头的活性。

（2）采用联苯胺一过氧化氢反应液漫过柱头法测定棉花当日花和次日花柱头的活性，表现为当日花柱头变色明显，产生的气泡多，田间授粉成铃率高，单铃健籽数多；次日花柱头变色不明显，产生的气泡少甚至无气泡产生，田间授粉成铃率虽较高，但单铃健籽数少。在花粉采用冷藏，授粉时测定花粉活力，基本排除花粉影响田间杂交结实因素的情况下，室内测定与田间授粉结果相一致，说明采用联苯胺一过氧化氢反应液漫过柱头法测定棉花柱头活性的方法是可靠的。

（3）本试验研究表明，棉花次日花柱头活性尚未达完全的生理成熟，虽能接受正常花粉受精结实，但结实性差。利用棉花高柱头材料或人工诱导棉花高柱头材料进行杂交制种，为保证种子纯度，若采用提前授粉，须探索活化棉花柱头活性的方法。

[1]李治华.陆地棉柱头外露种质资源研究[J].湘北农业科学,1990，（4）：28.

[2]何循宏，李秀章，陈祥龙，等.GA3对棉花花器形态、授粉和成铃性状的影响[J].棉花学报，2002，14（1）：36 ～ 40.

[3]景忆莲，刘耀斌，范万发.陆地棉花粉及柱头生活力研究[J].西北农业学报，2004，13（1）：45 ～ 48.

[4]崔瑞敏，崔淑芳，尹志敏.陆地棉花粉柱头生活力研究[J].河北农业大学学报，1998，21（20）：18 ～ 21.

[5]杨华，施庆华，潘群斌，等.棉花柱头生活力的研究初探[J].江西棉花，2006，28（5）：13 ～ 14.