澳洲长鳍鳗4种同工酶的组织特异性研究

2012-11-17李娴,朱永安,孟庆磊等

长江大学学报(自科版) 2012年17期

澳洲长鳍鳗4种同工酶的组织特异性研究

运用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对澳洲长鳍鳗(Anguillareinhardtii)5种组织(心脏、肝脏、肌肉、眼和肾脏)的4种同工酶[酯酶(EST)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、过氧化物酶(POD)、苹果酸脱氢酶(MDH)]进行了研究，并对其同工酶位点及酶谱进行了分析。结果表明，澳洲长鳍鳗的4种同工酶具有不同程度的组织特异性。EST检测到16个位点，多个位点存在等位基因。G6PDH检测到2个基因位点，其中1个位点存在等位基因。POD有3个位点，Pod-3检测到2个等位基因。MDH具有s-MDH和m-MDH 2种类型，s-MDH形成2种二聚体；m-MDH形成4种二聚体。这4种同工酶在表型、分布和活性上均表现出明显的组织特异性，可能与各组织执行的生理机能相关。

澳洲长鳍鳗(Anguillareinhardtii)；同工酶；组织特异性

中国鳗鱼养殖以欧洲鳗鲡和日本鳗鲡为主，总产量居世界第一，约占世界总产量的70%。世界各国养殖的鳗鱼苗种只能依靠近海的天然鳗苗资源，目前日本鳗鲡和欧洲鳗鲡苗种捕捞资源严重不足，无法满足现有养殖规模[1-3]。澳洲长鳍鳗(Anguillareinhardtis，英文名Australian longfin eel)隶属鳗鲡科鳗鲡属，产于澳大利亚东南部、洛德豪岛、新喀里多尼亚。因其形体大，俗称长鳍鳗、龙鳗。该品种生长速度快、性情温和、易于饲养、味道鲜美，是一种名贵鳗鱼，现在国内已有少数单位进行养殖和开发，具有良好的养殖开发前景。如能进行推广，可缓解当前日本鳗鲡和欧洲鳗鲡苗种不足的情况。目前对澳洲长鳍鳗的研究很少，本研究采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法探讨了澳洲长鳍鳗4种同工酶在5种组织中的分布、类型、活性等，以期为澳洲长鳍鳗的种质资源鉴定和遗传结构分析提供有价值的生化指标。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鱼取自山东省淡水水产研究所，体长25～45cm，体重376～928g。

1.2 样品制备

取试验用鱼共30尾，剪断尾动脉和鳃，在流水中放血以减少组织带血，然后迅速摘取眼睛、心脏、肾脏、肝脏、肌肉等组织，用预冷的0.8%生理盐水将各组织冲洗干净，取适量称重，放入预冷的研钵中，用消毒的剪刀剪碎，加入预冷的0.01mol/L的pH7.4的磷酸缓冲液(组织∶缓冲液=1g∶3ml)，冰浴中研磨，研磨成浆后置4℃抽提1～2h，4℃15000r/min离心30min，取上清液，加入等体积的40%的蔗糖溶液，分装，置-20℃保存备用。

1.3 电泳及染色

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法，分离胶浓度(T)为7.0%或7.5%，浓缩胶浓度为4%或3%。电泳缓冲液为Tris-Gly，高离子强度电泳缓冲液(pH8.3)或低离子强度电泳缓冲液(pH8.7)。梯度胶的浓度和缓冲系统见表1，点样量为20μl，以溴酚蓝作指示剂，电泳在4℃冰箱进行。同工酶的染色方法参照文献[4-7]稍作改进。同工酶的命名和分析参照文献[7-8]，以各酶带的相对迁移率(Rf)从小到大依次命名，即向阳极泳动最快的编为1号，依次顺序编为2、3、4、…，同一基因位点的不同等位基因按照从阴极到阳极的顺序依次标记为a、b、c、…。

对澳洲长鳍鳗5种组织的4种酶类进行多次电泳，筛选出酶谱清晰的结果进行分析。

表1 用于分析澳洲长鳍鳗同工酶的名称、编号、缓冲系统和凝胶浓度

注：TG8.3指Tris-甘氨酸高离子强度电泳缓冲液(pH8.3)；TG8.7指Tris-甘氨酸低离子强度电泳缓冲液(pH8.7)。

2 结果与分析

2.1 酯酶(EST)

L:肝脏(liver)；H:心脏(heart)；K:肾脏(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

鱼类的酯酶较复杂，一般认为是单体酶或多聚体酶，由多个基因位点编码[9]，多态现象非常普遍[7]。从澳洲长鳍鳗不同组织的EST电泳图谱(图1)可以看出，EST在澳洲长鳍鳗的心脏、肝脏、肌肉、眼和肾脏中都有分布，共有16个位点；肝脏和肾脏EST表达丰富，肝脏有12条酶带，肾脏有13条酶带，心脏和眼中表达次之，心脏8条酶带，眼中7条酶带，肌肉中表达最弱，有7条酶带。Est-9和Est-10这2个位点在5种组织中都表达，且都有2个等位基因，Est-6在肝脏中有2种基因型aa、bb，在肾脏中只有1种基因型aa。

2.2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)

G6PDH为二聚体酶[10]，由G6pdh-1、G6pdh-2这2个基因座位编码。澳洲长鳍鳗的G6PDH在肝脏和肾脏中表达，G6pdh-1在肝脏表达很弱，肾脏表达较明显，且表现出2种基因型，G6pdh-2在肝脏表达量较大，肾脏表达很弱(图2)，组织差异性显著。

L:肝脏(liver)；H:心脏(heart)；S:脾脏(spleen)；K:肾脏(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

2.3 过氧化物酶(POD)

POD是一类清除细胞内H2O2的同工酶，具体为几聚体还未有定论，有学者认为是二聚体酶[9,11]。澳洲长鳍鳗的POD有3个位点，分别为Pod-1、Pod-2、Pod-3，其中Pod-1和Pod-2只在心脏中表达，Pod-3在5个组织中都表达，有2个等位基因(图3)。

2.4 苹果酸脱氢酶(MDH)

硬骨鱼的苹果酸脱氢酶为二聚体，存在有相互不形成异聚体的上清液型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH)2部分，均是由2基因编码的二聚体[12]。澳洲长鳍鳗的MDH也具有s-MDH和m-MDH 2种类型(图4)，s-MDH形成2种二聚体，s-Mdh1在心脏和肾脏中表达，s-Mdh2在心脏和肌肉中表达；m-MDH形成4种二聚体，m-Mdh1仅在肝脏中表达，m-Mdh2在心脏和肝脏中表达，m-Mdh3在心脏、肝脏、眼、肾脏中都表达，m-Mdh4仅在眼中表达，澳洲长鳍鳗的MDH在不同组织中的表达差异显著。

L:肝脏(liver)；H:心脏(heart)；K:肾脏(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

3 讨论

3.1澳洲长鳍鳗不同组织同工酶表达的特异性及其与功能的关系

EST属于水解酶类，能催化酯键水解，对于脂类代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用[13]。一般认为在硬骨鱼类中EST是单体或二聚体，由多个位点编码，多态现象非常普遍。澳洲长鳍鳗肾脏和肝脏中EST的含量比较丰富，这和赤点石斑鱼、暗纹东方鲀、青海湖裸鲤等鱼类的EST表达类似[9,14-15]，可能与肝、肾组织脂类代谢和机体的解毒作用密切相关。同时，从澳洲长鳍鳗EST的表达酶谱上看，与其他已报道的鱼类相比，澳洲长鳍鳗EST表达量大，且酶带很多，这可能与澳洲长鳍鳗体内脂肪含量丰富、脂类代谢旺盛相关。龙华等[16]曾报导过欧洲鳗和日本鳗肝脏、心脏和肌肉中的EST酶谱；与澳洲长鳍鳗相比，欧洲鳗和日本鳗这3种组织中的EST表达不及澳洲长鳍鳗EST表达丰富，3种鳗鱼的EST表达有显著区别，因此，肝脏、心脏的EST表达酶谱可用于鉴别澳洲长鳍鳗、欧洲鳗和日本鳗。

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G6PDH为二聚体酶，是糖代谢中磷酸戊糖途径的关键酶，该途径产生的NAPDH能被细胞广泛用来驱使还原性厌氧途径，为生物合成提供动力，如脂肪酸、固醇类物质的合成等，产生的磷酸戊糖参与核酸代谢[17]。澳洲长鳍鳗的G6PDH在肝脏和肾脏中表达，肝脏中G6pdh-2表达量较大，肾脏中G6PDH表达很弱，但G6pdh-1表现出多态性，其他组织未见表达或表达太弱，现使用的检测方法无法检出，澳洲长鳍鳗G6PDH的表达组织差异性显著。澳洲长鳍鳗G6PDH的表达情况与与已报道的鲈鱼、虹鳟等鱼类表达类似[10,12]，都是肝脏中活性最强，这应与肝脏的功能密切相关。

POD是一类清除细胞内H2O2的同工酶，其主要功能是清除氨基酸分解代谢及糖醛酸合成代谢等过程中形成的过氧化物。动物的甲状腺细胞、具有吞噬功能的白细胞等含有丰富的过氧化物酶，因此在血流丰富、白细胞及吞噬细胞含量较多的心脏、肝脏、肾脏中同工酶POD的表达较强，而肌肉中表达较弱或无表达[9]。澳洲长鳍鳗的POD由3个基因座位编码，心脏中表达最为强烈且Pod-1、Pod-2、Pod-3都有表达，肾脏中POD活性也比较强，Pod-3在各种组织中均存在，可能在细胞中执行最基本的功能。澳洲长鳍鳗的POD表达和已报导的暗纹东方鲀的POD表达[18]很类似。

MDH是糖代谢三羧酸循环过程中的重要酶类，在细胞中的功能主要是使苹果酸脱氢参与糖酵解后的有氧代谢[19]。因此，MDH在心脏、肝脏等有氧代谢旺盛的组织中染色较深。从图4可知，澳洲长鳍鳗肝脏和心脏中POD活性较强，肾脏次之，肌肉和眼中活性较弱，这与肝脏和肾脏有氧代谢旺盛密切相关。

3.2 澳洲长鳍鳗同工酶的表达具有明显的组织特异性

综上所述，通过澳洲长鳍鳗的4种同工酶研究可以看出，澳洲长鳍鳗这4种同工酶的表达在不同组织间差异性显著，且这种表达上的特异性是与各组织的功能相一致的；同时，通过与已报导的日本鳗和欧洲鳗同工酶谱比较，发现肝脏、心脏的EST表达酶谱可用于鉴别澳洲长鳍鳗、欧洲鳗和日本鳗。

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[2]樊海平.我国鳗鲡养殖业的现状与发展对策(下)[J].科学养鱼,2006,(3):1-2.

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[8]熊全沫.鱼类同工酶谱分析(上)[J].遗传,1992,14(2):41-44.

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