跑台运动对去卵巢大鼠肝脏GSK-3β和PPAR-γ蛋白表达的影响

段玉双卜淑敏杨少锋王国娇

1潍坊医学院（山东潍坊261053） 2首都体育学院

绝经女性由于卵巢功能衰退易发生肥胖，肥胖导致脂代谢紊乱，而肝脏是脂质代谢的主要场所之一。研究表明，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）在脂肪酸氧化及脂质代谢中起重要作用，是脂类代谢的关键调控因子[1]。相关研究表明，大鼠经过16周跑台运动后，训练组所有组织PPAR-γ表达均升高[2]。单独运动对去卵巢大鼠肝脏GSK-3β和PPAR-γ蛋白表达的影响鲜见报道。我们的前期研究表明，跑台运动显著抑制去卵巢大鼠体重和腹腔内脂肪重量增加[3]，在此基础上，本研究进一步观察了中等强度跑台运动对去卵巢大鼠肝脏在Ser9位点磷酸化的GSK-3β（PGSK-3β）和PPAR-γ蛋白表达的影响，为探讨运动对去卵巢大鼠肝脂代谢影响的机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

健康3月龄雌性SD大鼠80只，体重（230±10）g。购自并饲养于北京大学医学部实验动物科学部[实验动物生产许可证号:SCXK （京）2006-0008，使用许可证号为:SYXK（京）2006-0025]。适应饲养1周后，按体重分层后随机分为假手术组（Sham，20只）和去卵巢手术组（OVX，60只）。手术前，两组大鼠均禁食12～18h，腹腔注射水合氯醛（0.3 ml/100g）麻醉，去卵巢手术组均从背部切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，只将卵巢旁与卵巢等大的脂肪组织切除。术后恢复1周，按体重分层后将去卵巢手术组大鼠又随机分为去卵巢静止 （OVX）、去卵巢运动（EX）和雌激素（E2）3 个组，每组 20 只。

1.2 运动训练和17β-雌二醇注射方案

跑台运动训练和17β-雌二醇配制及注射方案均参考我们前期研究报道[4]并适当调整。手术后第2周，去卵巢运动组大鼠在小动物跑台上开始适应训练1周，跑速从第1天的15 min、0坡度逐渐增加到第5天的45 min、坡度5°。正式运动训练方案为跑速18 m/min、时间45 min、坡度5°，每周 5次。 从手术后第2周开始，每周一、三、五上午9点，雌激素组颈部皮下注射3次17β-雌二醇，注射剂量为25 μg/kg体重。所有处理均在上午进行。每周称体重1次，根据体重调整17β-雌二醇的注射剂量。假手术组和去卵巢静止组每天只在笼中自由活动。

1.3 样品采集和处理

分别于去卵巢后7周和14周时各处死一半动物。取材前大鼠均禁食12～14h，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，迅速将同一部位的一块肝脏切成小块分装入Eppendof离心管后，-80℃冷冻保存以提取蛋白。

1.4 主要试剂和仪器

17β-雌二醇:Sigma公司；水合氯醛注射液:由北京大学医学部实验动物科学部提供；PPAR-γ抗体（SC-7273）和 β-actin 抗体（sc-1616R）:美国 Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG或马抗小鼠IgG/碱磷酶标记抗体:中杉金桥生物技术有限公司分装；BCIP/NBT显色浓缩液:中杉金桥生物技术有限公司分装；RIPA蛋白裂解液（P0013B）:碧云天生物技术有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（P0015）:碧云天生物技术有限公司；DSPT-202小动物跑台:杭州段氏制造厂；DYY-7C型电泳仪:北京六一仪器厂。

1.5 Western blotting 测定 GSK-3β、P-GSK-3β 和PPAR-γ蛋白表达

取200 mg肝脏在液氮中研磨成粉末，加入1 ml组织裂解液，4℃、12000 r/min 离心 30 min，取上清，留一部分检测蛋白浓度，其余蛋白样品与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）（按照 4∶1）混匀，沸水煮 5 min，分装后-40℃保存。取蛋白样品40 μg上样，以80V电压，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离约2 h后，以80V电压转移2 h。在质量分数为5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，将PVDF膜与按说明书稀释的GSK-3β（1∶800）、P-GSK-3β（1∶800）、PPAR-γ（1∶600）或 β-actin（1∶600）一抗 4℃过夜，次日 TBST 洗 3×10 min，分别加山羊抗兔 IgG/碱磷酶标记（1∶800）或马抗小鼠 IgG/碱磷酶标记（1∶800）二抗室温孵育 2 h，TBST 洗 3×10 min，在BCIP/NBT显色液中显色至条带出现，放入水中终止显色，拍照，扫描各条带灰度值。

1.6 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据采用均数±标准差表示，组间比较采用One-Way ANOVA，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。

2 结果

2.1 肝脏P-GSK-3β/GSK-3β比值

手术后第7和14周时，去卵巢静止组大鼠肝脏P-GSK-3β/GSK-3β比值显著低于假手术组 （P<0.01），去卵巢运动组和雌激素组肝脏P-GSK-3β/GSK-3β比值均显著高于去卵巢静止组（P<0.01），结果分别见图1和图2。

2.2 肝脏PPAR-γ蛋白表达

手术后第7和14周时，去卵巢静止组大鼠肝脏PPAR-γ蛋白表达量显著低于假手术组（7周时P<0.05，14周时P<0.01），而去卵巢运动组和雌激素组肝脏PPAR-γ蛋白表达量均显著高于去卵巢静止组（P <0.01），结果见图 3和图 4。

3 讨论

脂代谢紊乱是妇女绝经后面临的机体异常之一，是内源性雌激素水平下降所致[5]。肝脏是脂类代谢的重要场所，能够分泌多种酶类，参与调节脂类的消化、吸收、运输、分解代谢和合成代谢等，而GSK-3β和PPAR-γ是其中的调控因子之一。

国内外模拟临床绝经导致脂代谢紊乱常采用去卵巢大鼠模型[6]。我们前期研究表明，去卵巢7周和14周，与假手术组相比，去卵巢静止组体脂含量、肝脏TC、TG显著升高，而肝脏重量和指数未见显著变化[4]，表明去卵巢大鼠在肝脏重量和指数未见明显改变的情况下，腹腔内脂肪积累，肝脏已发生脂代谢紊乱。

GSK-3β是一种多功能蛋白激酶。以往研究表明[7]，GSK-3β 在 N 端 Ser9 位点发生磷酸化后，活性降低。本研究以P-GSK-3βSer9相对于总GSK-3β的比值作为判断其活性的依据。GSK-3β可抑制糖原合成及葡萄糖转运，促进糖异生，抑制胰岛素的分泌并阻碍胰岛素信号转导，从而发挥升高血糖的作用。运动对GSK-3β蛋白表达的影响研究比较晚，且大部分集中在运动通过GSK-3β调节和改善胰岛素抵抗方面。Bishop等[8]研究证实:糖尿病鼠肝脏GSK-3β mRNA是对照组的143%，且糖尿病鼠肝脏GSK-3β半衰期延长为8 h，而对照组为5 h。在培养的糖尿病肝细胞的介质中，补充胰岛素可以降低GSK-3β mRNA到接近正常水平。陈丹等[9]实验发现:大鼠运动锻炼6周后骨骼肌GSK-3β含量较胰岛素抵抗组减少27.24%，即运动能降低胰岛素抵抗大鼠骨骼肌细胞GSK-3β蛋白表达水平。但目前运动对去卵巢大鼠肝脏GSK-3β蛋白表达及磷酸化水平的影响尚不清楚。本实验中，去卵巢静止组P-GSK-3β/GSK-3β显著降低，而运动干预7周和14周后，此比值显著升高，说明运动有效抑制去卵巢大鼠肝脏GSK-3β蛋白表达和/或增加GSK-3β在N端Ser9位点磷酸化水平而降低其生理学效应，从而减轻GSK-3β对其下游靶对象的负性调节，但其机制还有待进一步研究证实。

PPAR-γ是一种核转录受体，属于PPAR家族（PPARs）。PPAR-γ除了在脂肪细胞分化中起关键作用外，还在介导脂肪酸氧化及脂质代谢中起重要作用[10]，是脂类代谢的关键调控因子。运动与PPAR-γ关系的研究大部分集中在运动通过PPAR-γ来调节胰岛素抵抗、脂肪分化和抗炎症等方面。陈玉娟等[11]研究发现:8周耐力游泳运动可促进大鼠脂肪组织PPAR-γ蛋白表达量增加。冯彦景[12]研究发现，经12周游泳训练可使胰岛素抵抗小鼠肝脏PPAR-γ蛋白表达水平显著升高。在去卵巢模型中，肝脏PPAR-γ蛋白表达情况及运动对其影响鲜见报道。本实验中，去卵巢手术后第7周和14周时，大鼠肝脏PPAR-γ蛋白表达量均降低，而中等强度跑台运动和雌激素干预7周和14周均能使去卵巢大鼠肝脏PPAR-γ蛋白含量显著增加。说明运动和雌激素均能有效而稳定地上调肝脏PPAR-γ蛋白表达。运动时机体发生很多变化，包括激素反应、能量代谢和酸碱平衡等，这些可能影响PPARs家族基因在肝脏组织中的表达，而PPAR-γ能够诱导肝细胞表达载脂蛋白、脂肪酸氧化酶系与脂蛋白脂酶等，从而促进脂质的氧化代谢，降低血脂浓度；介导载脂蛋白apoA-1表达；促进脂蛋白脂肪酶合成，使乳糜微粒和极低密度脂蛋白合成减少，促进脂质代谢平衡，从而起到改善机体脂质代谢紊乱的作用。

4 小结

本实验结果表明，中等强度跑台运动上调去卵巢大鼠肝脏P-GSK-3β/GSK-3β比值及PPAR-γ蛋白表达，且效果稳定。

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