一株槐树内生真菌发酵产物对羟自由基所致小鼠肝组织过氧化的体外作用

史佳琴，陈 强，王梅霞，陈双林

（南京师范大学生命科学学院，江苏南京210046）

一株槐树内生真菌发酵产物对羟自由基所致小鼠肝组织过氧化的体外作用

史佳琴，陈 强，王梅霞，陈双林*

（南京师范大学生命科学学院，江苏南京210046）

为了研究初筛获得的具有较高抗氧化活性和清除O2-·能力的槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物对·OH导致的氧化损伤的抑制作用及其清除·OH的效果，采用Fe2+-H2O2和Fe2+-VC两种羟自由基发生系统，以硫代巴比妥酸法测定了小鼠肝匀浆及肝线粒体中脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量，以分光光度法测定了小鼠肝线粒体的膨胀程度。结果表明，槐树内生真菌No.7发酵液提取物具有清除·OH的作用，能抑制小鼠肝脏脂质过氧化，从而降低线粒体氧化损伤及肿胀。

槐树，内生真菌发酵产物，羟自由基，抗氧化

植物内生真菌是一类存在于健康植物体内的微生物[1]，一般能够产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质，是具有新活性或新结构的天然物质的潜在资源库[2-4]。国内外一些近年的研究表明，植物内生真菌具有抗氧化活性或可产生抗氧化的活性产物[5-7]。槐树Sophora japonica L.为豆科槐属中的木本药用植物，含有芸香甙、甾醇、刺槐素、槲皮素等多种抗氧化活性成分[8-9]，我们对槐树的内生真菌的抗氧化活性进行了研究，分离到12株槐树具有不同程度的总抗氧化活性和清除O2-·的能力的内生真菌[10]。在此基础上，本文选择了其中抗氧化活性和O2-·清除能力均最高的菌株No.7（镰刀菌Fusarium sp.），研究了其发酵液提取物对·OH的清除效果以及在体外对小鼠肝组织的脂质过氧化及肝线粒体肿胀度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种小白鼠 雌雄各半，体重（22±2）g，购自南京医科大学；槐树内生真菌抗氧化活性菌株No.7（镰刀菌Fusarium sp.） 本实验室自行分离和保存；硫代巴比妥酸（TBA）、水杨酸钠、硫酸亚铁（FeSO4）、维生素C（VC）、双氧水（H2O2）、三氯乙酸（TCA）、蔗糖等 均为分析纯。

超速离心机 Sigma公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LGJ1.5冷冻干燥器 北京四环实验仪器厂；UV-2802H紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；组织匀浆器。

1.2 实验方法

1.2.1 槐树内生真菌培养液提取物的制备 活化保存槐树内生真菌菌株No.7菌种，然后取少量菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，250mL三角瓶、100mL装液量，27±1℃、150r/min培养7d。滤除菌丝，滤液用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，加入等量95%乙醇振荡提取，5000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液再浓缩至粘稠后真空干燥得粗提物。

1.2.2 小鼠肝线粒体悬浮液制备[11]小鼠禁食14h，断颈脱臼处死。取小鼠肝组织在冰浴条件下加入0.25mol/L蔗糖溶液，于组织匀浆器内研磨制成10%匀浆，3000r/min、4℃离心20min，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗两次，合并上清液，10000r/min、4℃离心20min，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗两次，合并沉淀。所得沉淀即为线粒体，将新鲜制备的线粒体用0.02mol/L、pH7.4的Tris-HCl溶液配成吸光度为0.7～0.8的线粒体悬浮液，冰箱冷藏室中存放备用。

1.2.3 槐树内生真菌活性菌株发酵液提取物清除·OH效果的测定 按Smirnoff的方法改进[12]。用FeSO4+ H2O2反应体系产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。反应总体系为3mL，依次加入0.15mmol/L FeSO4、2mmol/L水杨酸钠以及不同浓度的样品即菌株No.7发酵液提取物，最后加入6mmol/L H2O2启动反应，37℃反应1h，测510nm处的吸光值。每个处理重复三次。吸光值越低，表明清除·OH效果越好。

·OH的清除率（%）={[A0-（Ai-Ai0/A0）]}×100%

其中：A0为空白对照的吸光值；Ai为含某浓度样品时的吸光值；Ai0为无显色剂时样品的本底值。

1.2.4 对Fe2+－H2O2诱导肝匀浆脂质过氧化的影响[13]取小鼠的肝组织，用冷的生理盐水洗净后冰浴下匀浆，制成1%的悬浮液。取1%肝匀浆1mL，加入不同浓度的菌株No.7发酵液提取物样品0.2mL，再加入6mmol/L FeSO40.1mL和60mmol/L H2O20.1mL，以0.2mL的无水乙醇代替样品处理作为诱发·OH导致过氧化的对照组，同时设空白处理作为自发过氧化的对照。每个处理重复三次。37℃温育1h后，加入25%TCA 1mL，终止反应，以3000r/min离心10min，取上清液，加0.67% TBA 1mL后，沸水浴15min，流水冷却，测定532nm处的吸光值和丙二醛（MDA）含量。

对H2O2诱导过氧化时产生MDA的抑制率（%）= [（B0-Bi）/B0]×100%，其中，B0为诱发过氧化对照处理的MDA含量，Bi为某浓度样品处理下的MDA含量。

1.2.5 对Fe2+－VC系统诱导肝线粒体肿胀度的影响[14]取线粒体悬液1.2mL，依次加入0.2mL的菌株No.7发酵液提取物样品、0.2mL的42.5μmol/L FeSO4和0.1mL的0.85mmol/L VC，在520nm处测吸光值，每20min测一次，观察吸光值下降情况。以不加发酵液样品的处理为诱发·OH导致过氧化损伤的对照，每个处理重复三次。

1.2.6 对Fe2+－VC系统诱导肝线粒体脂质过氧化的影响[15]线粒体悬液1mL，依次加入0.2mL的菌株No.7发酵液提取物样品、0.1mL的0.2mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲溶液、0.05mL的3.5mol/L KCl溶液、0.2mL的5mmol/L FeSO4和0.1mL的10mmol/L VC，37℃温育1h，测定532nm处的吸光值和MDA含量，计算MDA抑制率。每个处理重复三次。

2 结果与分析

2.1 槐树内生真菌活性菌株发酵液提取物清除·OH的效果

表1 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物清除·OH的效果（n=3，±s）Table 1 The scavenging effect of extracts from the endophytic fungal strain No.7 on·OH（n=3，±s）

表1 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物清除·OH的效果（n=3，±s）Table 1 The scavenging effect of extracts from the endophytic fungal strain No.7 on·OH（n=3，±s）

注：A为与对照相比差异极显著（Plt;0.01）。

·OH清除率（%）空白对照CK 0 1.596±0.047处理1 50 1.312±0.004A 17.79处理2 100 1.056±0.069A 33.83处理3 200 0.424±0.018A 73.43处理4 500 0.125±0.035A 92.17处理 样品浓度（μg/mL） A510nm

由表1的结果可以看出，槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物不同浓度样品的各处理的A510nm值明显低于对照，表明不同浓度的样品均具有清除·OH的作用，且随着样品浓度的增加，其清除·OH的效果亦增加。当样品浓度达到200μg/mL时，对·OH的清除率超过50%，浓度达500μg/mL时，对·OH的清除率高达92.17%。

2.2 对Fe2+-H2O2诱导肝匀浆脂质过氧化的影响

表2 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物抑制Fe2++H2O2诱发的MDA的效果（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on malondialdehyde induced by Fe2++H2O2（n=3，±s）

表2 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物抑制Fe2++H2O2诱发的MDA的效果（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on malondialdehyde induced by Fe2++H2O2（n=3，±s）

注：与Fe2++H2O2处理相比的差异显著性，A：Plt;0.01；a：Plt;0.05。

（μg/mL） A532nm 丙二醛抑制率（%）空白对照CK 0 0.176±0.068 Fe2++H2O2 0 0.521±0.088 Fe2++H2O2+样品 25 0.399±0.077A 23.42 Fe2++H2O2+样品 50 0.311±0.025A 40.31 Fe2++H2O2+样品 100 0.285±0.050A 45.30 Fe2++H2O2+样品 200 0.198±0.045a 62.00处理 样品浓度

由表2可见，Fe2++H2O2处理与对照相比的A532nm值显著增加，说明Fe2++H2O2反应体系产生的·OH可促使小鼠肝组织体外脂质过氧化反应。Fe2++H2O2+菌株No.7发酵液提取物样品的各处理对MDA的生成均具有抑制作用，说明槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物可抑制诱发的·OH所致小鼠肝组织体外脂质过氧化的发生，而且抑制诱发的小鼠肝组织体外脂质过氧化时产生MDA的能力随样品浓度增加而提高。

2.3 对Fe2+－VC系统诱导肝线粒体肿胀度的影响

表3的结果表明，随着作用时间的延长，作为对照的模型处理组的A520nm持续下降，以处理后20min内下降的幅度最大，说明·OH诱导加速了小鼠肝线粒体在体外的氧化损伤，导致肿胀迅速加重。菌株No.7发酵液提取物样品各处理的A520nm也逐渐下降，表明其中也发生了线粒体在体外因氧化损伤而发生肿胀，不过，含No.7发酵液提取物样品的三组处理与Fe2++VC的模型处理相比下降缓慢，而且在相同作用时间内的A520nm值均高于空白对照，表明No.7发酵液提取物可在一定程度上抑制·OH所导致的氧化，使小鼠肝线粒体的肿胀减轻，损伤程度降低，且菌株No.7发酵液提取物浓度与减轻小鼠肝在体外因氧化损伤而导致的线粒体肿胀的效果之间具有量效关系。

表3 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物对Fe2++VC作用小鼠肝线粒体的吸光值（A520，n=3，±s）Table3 Effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on mitochondria swelling induced by Fe2++VC（n=3，±s）

表3 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物对Fe2++VC作用小鼠肝线粒体的吸光值（A520，n=3，±s）Table3 Effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on mitochondria swelling induced by Fe2++VC（n=3，±s）

注：A为与损伤对照相比差异极显著（Plt;0.01）；a为与空白对照相比差异显著（Plt;0.05）。

20 40 60 80 100 120空白对照CK 0.410±0.014 0.366±0.009 0.351±0.031 0.342±0.015 0.333±0.013 0.328±0.033 0.316±0.013损伤处理对照 0.403±0.012 0.286±0.007 0.266±0.016 0.262±0.040 0.256±0.026 0.253±0.031 0.245±0.048样品（50μg/mL） 0.413±0.014 0.387±0.010Aa 0.369±0.020Aa 0.358±0.010Aa 0.350±0.015Aa 0.346±0.029Aa 0.347±0.060Aa样品（100μg/mL） 0.421±0.021 0.415±0.011Aa 0.410±0.080Aa 0.398±0.033Aa 0.385±0.036Aa 0.376±0.028Aa 0.370±0.023Aa样品（200μg/mL） 0.430±0.020 0.423±0.024Aa 0.420±0.027Aa 0.418±0.021Aa 0.414±0.031Aa 0.412±0.014Aa 0.409±0.032Aa处理 时间（min）0

2.4 对Fe2+－VC系统诱导肝线粒体脂质过氧化的影响

表4 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物抑制Fe2+－VC系统诱导肝线粒体脂质过氧化的效果（n=3，±s）Table 4 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on lipid peroxidation in liver mitochondria induced by FeSO4－VC（n=3，±s）

表4 槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物抑制Fe2+－VC系统诱导肝线粒体脂质过氧化的效果（n=3，±s）Table 4 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on lipid peroxidation in liver mitochondria induced by FeSO4－VC（n=3，±s）

注：A为与Fe2++VC处理相比差异极显著（Plt;0.01）。

处理 样品浓度（μg/mL） A532nm 丙二醛抑制率（%）空白对照CK 0 0.321±0.002 Fe2++VC 0 0.630±0.028A Fe2++VC+样品 50 0.440±0.008A 30.16 Fe2++VC+样品 100 0.409±0.004A 35.08 Fe2++VC+样品 200 0.376±0.028A 40.32 Fe2++VC+样品 400 0.339±0.029A 46.19

由表4可见，槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物能够在体外显著抑制FeSO4－VC系统诱导小鼠肝线粒体脂质过氧化产物MDA的生成，且在体外抑制肝线粒体脂质过氧化时产生MDA的能力随样品浓度增加而提高，具有较好的量效关系。提取物浓度为400μg/mL时，对Fe2+－VC系统诱导的肝线粒体MDA发生量的抑制率达46.19%，高浓度的No.7发酵液提取物对线粒体膜有较好的保护作用。

3 讨论

大量的研究表明羟自由基（·OH）是体内最活泼的活性氧，可介导许多病理变化，因此对羟自由基的清除能力是评价天然产物抗氧化活性能力的重要指标之一[16-17]。丙二醛（MDA）是脂质过氧化生成的过氧化物的最终分解产物，其含量变化可反映生物膜的受损程度和细胞脂质过氧化程度，也间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。肝脏是反映脂质过氧化较为敏感的器官，所以肝脏中MDA的含量间接反映着细胞的脂质过氧化程度[18]。过氧化损伤会导致生物膜通透性增加，进而引起线粒体膨胀和红细胞溶血等。本文在对槐树内生真菌抗氧化活性和清除O2-·的能力研究的基础上[10]，进一步研究了槐树内生真菌抗氧化活性菌株No.7发酵液提取物在体外对小鼠肝匀浆和线粒体的脂质过氧化及肝线粒体肿胀度的影响。实验处理中，不论是Fe2+-H2O2还是Fe2+-VC的·OH发生系统都能引起小鼠肝组织的体外脂质过氧化，并诱发MDA的生成。而槐树内生真菌菌株No.7的发酵液提取物对·OH清除效果比较显著，也能在一定程度上抑制·OH所致的膜脂质过氧化，从而降低或避免了膜系统遭受·OH损伤，保证了膜的流动性。表3中，Fe2+－VC的·OH发生系统处理的对照低于空白处理的正常组，反映出这一·OH发生系统诱发的脂质过氧化超过了自发过氧化，而添加槐树内生真菌菌株No.7发酵液提取物样品的处理高于空白处理的正常组，表明其在体外对诱发的过氧化和自发的过氧化都具有抑制作用，表现在能够减轻线粒体因氧化损伤发生的肿胀，有助于维持正常的生理功能。研究结果再次证明了植物内生真菌的发酵产物具有抗氧化活性作用[5-7]，启示人们开发和利用植物内生真菌产物生产具有保健价值或医疗价值的产品。

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Effect of fermentation broth extracts of the endophytic fungus isolated from Sophora japonica on lipid peroxidation of mice liver induced by hydroxyl radical in vitro

SHI Jia-qin，CHEN Qiang，WANG Mei-xia，CHEN Shuang-lin*
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China）

The antioxidative effect of fermentation broth extracts of the endophytic fungal strain No.7 isolated from Sophora japonica was studied.Hydroxy radical was generated from Fe2+-H2O2and Fe2+-VCsystem；MDA contents in liver homogenate and mitochondria were measured with thiobarbituric acid assay，and the swelling extent of mitochondria was detected by spectrophotometric methods.The results indicated that the fermentation broth extracts of this endophytic fungal strain isolated from Sophora japonica could scavenge·OH，inhibit the generation of MDA and reduce the swelling and oxidative damage of mitochondria.

Sophora japonica；fermented product of endophytic fungi；hydroxyl radical；antioxidation

TS201.4

A

1002-0306（2012）05-0366-04

2011－04－22 *通讯联系人

史佳琴（1981-），女，硕士研究生，主要从事微生物发酵产物的活性研究。