橘皮粗多糖的提取工艺优化及抗氧化活性评价
2012-11-15陈瑞战李世哲杨思敏
董 航,陈瑞战,李世哲,于 京,杨思敏,李 元
(长春师范学院化学学院,吉林长春130032)
橘皮粗多糖的提取工艺优化及抗氧化活性评价
董 航,陈瑞战*,李世哲,于 京,杨思敏,李 元
(长春师范学院化学学院,吉林长春130032)
为了优化橘皮粗多糖的微波提取工艺,评价橘皮粗多糖的抗氧化活性;通过Box-Behnken的中心组合设计及响应面法(RSM)建立了微波提取时间(min)、料液比(g/mL)、微波功率(W)的二次回归模型,对橘皮多糖的最佳微波提取工艺条件进行优化;并通过Fenton反应和有机自由基(DPPH·)法对其进行体外抗氧化活性测试。实验表明,最佳提取条件为微波提取时间18min、料液比1∶25(g/mL)、微波功率250W,在该条件下橘皮粗多糖的提取得率为33.71%,高于传统回流方法(15.75%)。橘皮粗多糖对·OH和DPPH·有显著的清除作用,可以探索作为食品工业和制药行业的天然抗氧化剂。
橘子皮,多糖,微波,工艺,抗氧化活性
橘皮,在我国的传统医药中又叫陈皮,系芸香科植物橘树的成熟果实之干燥果皮,味苦、辛,性温,归肺脾经。桔子皮含有多糖及大量对人体有益的维生素B和C、香精油、芳香油、麝香草酚等有机物[1]。研究表明,植物多糖具有降血糖[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]等多种生理功能。多糖能够参与细胞间的识别、机体免疫功能的调节、细胞间物质的运输、细胞的转化和凋亡等过程,不仅可以激活T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞等多种免疫细胞,而且可以活化补体系统,有效促进IL-1、IL-2、IL-6、TNF等细胞因子的分泌和表达[5],且毒性低,因此在多种疾病的临床应用和功能食品等方面具有良好的前景[6]。多糖的提取方法很多,例如传统的热回流提取,虽然操作简单,但耗能多、耗时长、提取效率低;超声酶解提取利用超声波和生物酶的双重影响快速有效地提取多糖成分[7-8];微波提取是在微波的高能磁场作用下,橘皮细胞内的果胶、多糖等物质被快速地提取。微波提取法选择性强、操作时间短、溶剂用量小、受热均匀、目标组分得率高,是一种有效可行的方法[9]。目前对橘子皮多糖提取的研究,多集中在加热浸提上,而关于直接微波提取工艺优化条件的研究少有报道。本文利用响应面法对橘皮粗多糖的微波提取工艺进行了优化,并进行橘皮粗多糖的体外抗氧化活性评价,以期为天然抗氧化剂的筛选和橘皮多糖的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
橘皮 市售橘子外皮;98%硫酸、苯酚、95%乙醇、氢氧化钠、硫酸亚铁、30%过氧化氢、石油醚、葡萄糖等试剂 均为国产分析纯,苯酚使用前经蒸馏处理,收集180~182℃馏分待用;DPPH 德国Sigma-Aldrich Chemie GmbH公司;藏红T 国药集团化学试剂有限公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 国药集团化学试剂有限公司。
UV-2450型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;HH-6恒温水浴锅,LD-4型离心机 金坛市科析仪器有限公司;RE-52CS-1型旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂;FA/JA电子天平 上海精密科学仪器有限公司;微波炉 青岛海尔有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料处理 市售橘皮自然晾干,用高速中药粉碎机粉碎成粉末。称取20g橘皮粉末,置于500mL圆底烧瓶中,加入石油醚,回流2h,脱去脂肪,抽滤,风干,重复一次。
1.2.2 微波法单因素实验 对预处理后的橘皮,考察料液比、微波提取时间、微波功率三个因素对提取率的影响,在其他因素保持相同的条件下,选择最优的工艺条件。
取一定量橘皮粉,以水为提取溶剂,按不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL)放入微波炉内,在120~700W下提取12~28min,提取液离心,上清液减压浓缩至一定体积后加入95%乙醇至乙醇最终浓度为60%(v/v),于室温下醇沉24h,离心,沉淀溶于水后用蒸馏水透析(截留分子量3500u的半透膜)36h,除去小分子成分,冻干得橘皮粗多糖。
1.2.3 回流法提取橘子皮多糖 在料液比1∶35g/mL,提取温度100℃,提取时间90min条件下,回流提取橘皮多糖[1]。提取液处理同1.2.2。
1.2.4 多糖含量的测定及标准曲线的制备 以葡萄糖为标准品,用苯酚-硫酸比色法测多糖的得率。按照参考文献[10]制备标准曲线,得线性回归方程A= 10.694C+0.0794,相关系数R2=0.9994,C是浓度(mg/mL),A为吸光值。
准确称取一定质量的粗多糖,加水溶解后定容成一定体积,用苯酚-硫酸法测定吸光值,代入回归方程计算多糖含量,并按下式计算多糖的提取得率:
橘子皮多糖提取得率(%)=(橘子皮多糖质量/原料质量)×100%
1.3 橘皮粗多糖的抗氧化活性评价
1.3.1 橘皮粗多糖对OH自由基的清除作用 根据宋茹[11]等人报道的方法,利用Fenton反应检测各种自由基清除剂对OH自由基的清除作用。·OH由EDTA Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2体系产生,由于·OH可特异地使番红花褪色,根据褪色程度用比色法来测定·OH的含量。反应体系中加入pH为7.4的磷酸缓冲液1.0mL,番红花(520μg/mL)0.2mL,EDTA Na2-Fe(Ⅱ)1.0mL,再加入不同浓度的样品溶液1.0mL,最后加入6%的H2O20.8mL,混匀后于40℃水浴保温30min,在波长514.9nm处测吸光值A。每个多糖浓度作三个平行样,取其平均值。空白组以等体积的重蒸水代替样品溶液;对照组以等体积的重蒸水代替样品溶液和EDTA Na2-Fe(Ⅱ)溶液。并与BHT对照比较。
式中:A0-空白组的吸光值,A1-多糖样品的吸光值,A2-对照组的吸光值。
1.3.2 橘皮粗多糖对DPPH自由基的清除作用 取不同浓度的粗多糖待测样品溶液3.0mL,加入1.0mL 1.0×10-4mol/L DPPH·甲醇溶液,立即混匀,在25℃条件下静置0.5h后,用分光光度计于517nm处测定吸光度Ai。则多糖对DPPH·的清除率(%)可表示为:
式中:Ai为DPPH·与样液反应后的吸光度,Aj为样品空白(样品3.0mL+1.0mL甲醇)的吸光度,Ac为未加样的DPPH·(1.0mL 1.0×10-4mol/L DPPH·甲醇溶液+3.0mL水)的吸光度,每一样品平行测三次,取其平均值,并与BHT对照比较。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 微波辐射时间对提取得率的影响 固定料液比为1∶10g/mL,微波功率为250W,考察提取时间(12、16、20、24、28min)对橘皮多糖提取得率的影响(见图1)。由图1可知,在12~16min的时间范围内,随着辐射时间的延长,粗多糖提取得率快速增加,当辐射时间超过20min时,再增加辐射时间,可能会对产物本身结构产生影响,提取率反而减小,因此适宜辐射时间为20min。
图1 微波辅助时间对橘皮多糖提取率的影响Fig.1 Effect of microwave assisted time on the extraction rate of polysaccharide from orange peel
2.1.2 料液比对橘皮多糖提取得率的影响 固定微波辐射时间为20min,微波功率为250W,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL)对橘皮多糖提取得率的影响(见图2)。由图2可知,随着料液比的增大,多糖提取率也逐渐增加,当料液比为1∶30g/mL时最大,再增加料液比,提取率反而减小。因为,微波法提取是靠微波穿透器壁将物料整体加热并打破细胞壁使得其中有效成分流出,提取液过多会迟缓加热的过程,提取率降低,从有效利用资源和降低能耗两方面考虑,最适宜料液比为1∶30g/mL。
图2 料液比对橘皮多糖提取率的影响Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on the extraction rate of polysaccharide from orange peel
2.1.3 微波功率对橘皮多糖提取率的影响 固定微波辐射时间为20min,料液比为1∶30g/mL,考察微波功率(120、250、450、600、700W)对橘皮多糖提取得率的影响(见图3)。由图3可知,随着微波功率的增大,多糖提取率也逐渐增加,当微波功率为250W时最大,再增加微波功率提取率反而减小,其原因可能是由于微波功率的增大,使橘皮的组织细胞遭到破裂,系统的温度升得很高,引起溶剂的剧烈沸腾,不仅造成溶剂的大量损失,而且还会带走已溶解入溶剂中的部分溶质,影响提取率。同时微波功率的增大,也有可能造成橘子皮多糖化学结构的变化,从而使多糖提取量下降。因此最适宜微波功率为250W。
图3 微波功率对橘皮多糖提取率的影响Fig.3 Effect of microwave power on the extraction rate of polysaccharide from orange peel
2.2 响应面分析与结果
根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,综合提取橘皮多糖的最佳条件的基础上,采用三因素三水平的响应面分析方法,实验设计因素及水平见表1。
表1 实验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of response surface experiments
2.2.1 响应面分析 采用Box-Behnken按表1响应面分析因素及水平表设计实验,共15组。每个自变量的低中高水平分别以-1、0、1进行编码,以橘皮多糖提取率为响应值(Y)进行实验,参照1.2.2进行提取,结果见表2。
表2 Box-Behnken设计方案及橘皮多糖得率的测定值Table 2 Box-Behnken experimental design and result
2.2.2 多元二次响应面回归模型的建立与分析 采用Design-Expert软件对表2的提取量和影响因素进行多元回归分析和最小二乘法拟合,得对编码自变量的二次多项回归模拟方程:y=20.45-4.02x1-3.57x2+ 0.77x3+3.62x1x2-1.13x1x3-6.55x2x3+1.28x12+4.04x22-6.54x32。该方程表达了橘皮多糖的提取率与微波各提取因素之间的变化规律。
其中,Y是效应值,即橘皮多糖的提取率,X1、X2和X3是自变量,即微波辐射时间、料液比和微波功率三个考察因素,因素的方差分析见表3。
表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance
由表3可知,响应面模型达到了较显著的水平,模型的R2值为0.8962,说明回归方程在整个回归区域的拟合情况良好。模型中的一次项X1和二次项中的X32影响达到较显著水平(P<0.05);交互项X2X3影响达到较显著水平(P<0.05)。由响应面模型得到最佳提取条件:-1,-1,+0.65,即微波辐射时间18min、料液比1∶25g/mL、微波功率380W,得到理论值为39.7013%。根据实验室条件调整为:微波辐射时间18min、料液比1∶25g/mL、微波功率450W,经验证其多糖提取率为30.47%,与响应面结果相比,实验号9的提取率更接近于理论值,综上,选取实验号9的工艺条件为最终提取条件。
图4 料液比和微波功率相互作用对橘皮多糖提取率的响应面Fig.4 Response surface of ratio of solid to liquid and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides
2.2.3 双因子间交互影响分析 由表3可知,所建立的模型中只有X2X3的相互作用达到较显著水平,即料液比和微波功率的相互作用对橘皮多糖的提取率有较显著影响(P<0.05),其作用如图4所示。由图4可知,随着料液比的增加,多糖提取率呈上升趋势,但趋势较小,说明料液比对橘皮多糖的提取率影响不显著。随着微波功率的增加,多糖提取率呈先上升趋势后趋于平稳。微波功率的增加,使体系的温度升高,加快了多糖的溶出速度,使多糖提取率逐渐上升。在较低料液比下,适当增加微波功率有利于多糖提取率的升高。
2.3 不同方法提取橘皮多糖的抗氧化活性的比较
2.3.1 橘皮多糖对·OH清除作用 由图5得知,在4~9.5mg/mL的有效浓度范围内,随着橘皮多糖浓度的增加,清除·OH的作用逐渐增强。当多糖浓度为9.5mg/mL时,微波提取的橘皮多糖对·OH的清除率达到60.89%,远高于回流提取的橘皮多糖(42.49%),因此橘皮多糖具有一定的清除·OH的能力。但与BHT相比清除能力较弱,当浓度为5mg/mL时,BHT对·OH的清除率达到77.76%,而微波提取的橘皮多糖对·OH的清除率达到34.76%。
图5 橘皮多糖对·OH的清除影响Fig.5 Effect of orange peel polysaccharides on·OH removal
2.3.2 橘皮多糖对DPPH·的清除作用 由图6可知,在0.5~4mg/mL的有效浓度范围内,随着橘皮多糖浓度的增加,清除DPPH·的作用逐渐增强。清除率与多糖浓度呈一定的量效关系。当多糖浓度为4.0mg/mL时,微波提取的橘皮多糖对DPPH·的清除率达到75.61%,高于回流提取的橘皮多糖(45.48%),也高于BHT(71.77%)。因此橘皮多糖体外有显著的清除DPPH·的作用。
图6 橘皮多糖对DPPH的清除影响Fig.6 Effect of orange peel polysaccharides on DPPH removal
3 结论
3.1 采用Box-Behnken的中心组合设计及响应面法(RSM)建立了微波辐射时间、料液比、微波功率的数学模型,确定最佳工艺条件为:微波辐射时间18min、料液比1∶25g/mL、微波功率250W,在该条件下橘子皮粗多糖的提取得率为33.71%,高于传统回流方法(15.75%)。表明微波法可以显著提高橘皮多糖的提取率。
3.2 与传统的回流提取工艺相比,微波提取具有提取省时、节能、抗氧化活性好等优点。
3.3 橘皮粗多糖能有效清除·OH和DPPH·,可以探索将其作为食品工业和制药行业的天然抗氧化剂。
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Optimization of extraction technology of orange peel crude polysaccharides and evaluation of its antioxidant activity
DONG Hang,CHEN Rui-zhan*,LI Shi-zhe,YU Jing,YANG Si-min,LI Yuan
(College of Chemistry,Changchun Normal University,Changchun 130032,China)
The response surface methodology was employed to study microwave extraction(ME)crude polysaccharide from orange peel,and the antioxidant activities of crude orange peel polysaccharide(OPP)was evaluated.The best possible combination of extraction parameters was obtained with the response surface methodology(RSM),at a three-variable,three-level experiment Box-Behnken design(BBD).The antioxidant activities of OPP was evaluate on the basis of Fenton reaction and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH·)free radical scavenging assay in vitro.The optimum extraction parameters were as follows:extracting time 18min,the ratio of solid to liquid 1∶25(g/mL),microwave power 250W.Under these conditions,the extraction yield of crude polysaccharide with ME was 33.71%,higher than that of classical refluxing extraction(15.75%). Furthermore,the antioxidant activities of OPP was evaluated on the basis of hydroxyl(·OH)and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH·)free radical scavenging assay,respectively.The results showed that the OPP possessing pronounced·OH and DPPH· free radical scavenging activity,might explore as a potential antioxidant in food industry and pharmaceuticals.In comparison with classical refluxing extraction,the ME showed obvious advantages in shorter extraction times,higher extraction yield,at lower energy costs,higher antioxidant activity and so on.
orange peel;polysaccharides;microwave;technology;antioxidant activity
TS201.2
B
1002-0306(2012)05-0215-05
2011-05-25 *通讯联系人
董航(1987-),女,硕士研究生,研究方向:天然产物分析。
吉林省自然科学基金项目(2010105);吉林省教育厅“十二五”科学技术研究重大项目(吉教科合字[2011]第185号)。