不同溶剂提取乳苣的抗氧化作用研究

高义霞，周向军，杨 声，刘周龙，王强强

（天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001）

不同溶剂提取乳苣的抗氧化作用研究

高义霞，周向军，杨 声，刘周龙，王强强

（天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001）

以乳苣全草为原料，75%乙醇为溶剂提取乳苣，提取液用不同极性溶剂依次萃取，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，同时测定了各相提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除能力，并与VC进行比较。结果表明：各萃取物均具有一定的抗氧化活性，且随着浓度的增加而增强；对羟自由基的清除能力大小依次为乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞VC＞水萃取物＞石油醚萃取物；对超氧阴离子自由基清除能力大小依次为VC＞正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物；对DPPH自由基清除能力大小依次为VC＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水萃取物＞石油醚萃取物；各萃取物还原能力大小依次为VC＞正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞水萃取物＞石油醚萃取物。

乳苣，活性成分，抗氧化

生物体内代谢过程中常发生氧化还原反应，不断产生自由基，进而引起DNA损伤、酶变性及功能紊乱等。因此适当补充外源抗氧化剂可以清除自由基、阻断脂质过氧化反应、预防和治疗病症等。由于一些人工合成的抗氧化剂如BHT、BHA、TBHQ等被动物实验证实有毒及人们越来越追求绿色环保消费，因而寻找安全、天然的抗氧化剂日益成为研究热点。乳苣（Mulgedium tataricum L.）又名蒙山莴苣、紫花山莴苣、苦菜等，多年生草本植物，分布在俄罗斯、欧洲印度、伊朗、阿富汗及我国东北、华北及西北等地，生长于海拔1200～4300m的地区，常生长在湖边、草甸、田边、河滩、固定沙丘以及砾石地[1]。茎叶可作猪饲料[2]，全草可药用，用于肠痈、痈种、丹毒、目赤、癖血腹痛、赤白带等[3]。民间作为野菜采食，有抗菌、消炎、止痛等功效。但因其味苦、植株小而未被充分利用，造成资源浪费。王晓雄等从乳苣全草中分离到三萜类和倍半萜类化合物，并确定了其结构[4－6]。本课题组前期实验发现，乳苣全草中含有丰富的黄酮类物质[7]。药理学表明，作为天然药物中含量最多、分布最广泛的活性成分之一——黄酮类物质具有抗病毒、抗菌、降压、抗肿瘤、抗氧化等作用。关于乳苣活性物质的抗氧化研究，目前未见报道。本实验采用乙醇回流及溶剂萃取相结合的方法，从乳苣全草中分离到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相提取物浸膏，并测定了总还原能力、清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的能力，并与VC相比较，评价其抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳苣（Mulgedium tataricum L.） 采自甘肃省白银市靖远县农田和水渠边，经天水师范学院生命科学与化学学院汪之波副教授鉴定为菊科乳苣属乳苣。乳苣全草，室温干燥，粉碎，过80目筛，备用；芦丁标准品 购自南京替斯艾么中药技术研究所（99%纯度）；DPPH（二苯代苦味肼基自由基）、抗坏血酸 Sigma公司；其他试剂 均为国产分析纯。

电子天平 北京赛多利天平有限公司；RE－52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZ－D循环水式真空泵 河南开封宏兴科教仪器厂；UV2450紫外－可见分光光度计 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 乳苣不同提取物的制备 取上述制备的乳苣全草粉末60g，置于圆底烧瓶内，以1∶40液固比加入75%乙醇，于90℃下回流提取1h，过滤，收集滤液，滤渣重复以上操作，合并两次滤液并浓缩至原体积的1/3，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，分别收集各相萃取液，浓缩并冷冻干燥至恒重，得干浸膏并计算得率，测定其总黄酮含量。

1.2.2 不同溶剂提取物清除羟自由基测定 以VC为对照，采用Fenton反应测定样品对羟自由基清除能力[8]。取0.75mmol/L邻二氮菲溶液1mL，PBS缓冲液（pH7.4）2mL和70%乙醇1mL，充分混匀后，加2.5mmol/L硫酸亚铁1mL，混匀，加0.1%的过氧化氢2.5mL，37℃保持60min，于波长200～600nm扫描确定最大吸收波长为510nm，测其吸光度，记为Ap。用2.5mL蒸馏水代替2.5mL过氧化氢，得吸光度为Ab。用不同浓度的样液1mL代替1mL乙醇，吸光度为As。·OH清除率（S1）=[（As－Ap）/（Ab－Ap）]×100%

1.2.3 不同溶剂提取物清除超氧阴离子自由基测定 取0.05mol/L Tris－HCl缓冲溶液（pH 8.2）4.5mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入0.1mL不同浓度的样液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8mmol/L HCl 1.0mL终止反应，于波长200～600nm扫描确定最大吸收波长为299nm，测定吸光度（Ai），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品，空白样吸光度（A0），平行进行3次实验，计算平均值[8]。清除率（S2）=（A0－Ai）/A0×100%

1.2.4 不同溶剂提取物清除DPPH自由基测定 准确称取DPPH标准品25mg，95%乙醇定容至250mL，得质量浓度为0.1g/L溶液。吸取3mL，加入不同浓度的样液1mL，摇匀，室温暗处放置30min，于波长200～600nm扫描确定最大吸收波长为517nm，测吸光度（Ai）。同时测1mL溶剂与3mL DPPH混合后吸光度（Ac），1mL样品液加3mL乙醇混合后吸光度（Aj）[8]。DPPH·清除率（S3）=[1－（Ai－Aj）/Ac]×100%

1.2.5 不同溶剂提取物还原能力测定 在2.0mL pH6.6 PBS缓冲液中加入不同浓度的样液1.0mL，0.1%的铁氰化钾溶液2.0mL，混合物在50℃恒温20min后，再加入2.0mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10min，取上层清液2mL，加蒸馏水2mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，静止10min后，于波长200～600nm扫描确定最大吸收波长为700nm，测定吸光度，吸光度越高，还原能力越强。A为样品，A0为对照[9]，△A=A－A0。

2 结果与分析

乳苣乙醇浸膏热水分散后，经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取物（PEP）、乙酸乙酯萃取物（EAE）、正丁醇萃取物（BE）和水萃取物（WE），提取率分别为7.33%、1.59%、1.75%、23.57%。分别测定各相浸膏总黄酮含量为5.28%、15.02%、12.6%、9.39%。

2.1 乳苣不同溶剂萃取物对羟自由基的清除率

图1 不同溶剂提取物对羟自由基的清除率Fig.1 Hydroxyl radical scavenging rate of different solvent extracts

取乳苣不同提取溶剂浸膏，稀释至一定浓度，测定其清除羟自由基的能力，结果见图1。由图可知，随样品浓度的增加，各相提取液对羟自由基的清除力增强。为了评价抗氧化剂的抗氧化性能和自由基的清除能力，常选择清除率为50%时抗氧化剂的质量浓度（EC50）作为评价指标，EC50越小，抗氧化剂清除自由基的能力越强[10]，利用SPSS16.0计算出PEP、BE、EAE、WE及VC的EC50分别为79.932、1.9、1.265、4.157、2.657mg/mL。由此可知，以上各项萃取物对羟自由基均有一定的清除作用，清除力强弱顺序为EAE＞BE＞WE＞PEP，与VC相比，EAE和BE效果优于VC。可推测乳苣EAE和BE具有较好的清除羟自由基作用，且发挥作用的成分主要在黄酮类提取部位。

2.2 乳苣不同溶剂萃取物对超氧阴离子自由基的清除率

图2 不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除率Fig.2 Superoxide radical scavenging rate of different solvent extracts

取乳苣不同提取溶剂浸膏，稀释至一定浓度，测定其清除超氧阴离子自由基能力，结果见图2。可知随样品浓度的增加，各相提取液对超氧阴离子自由基的清除力增强。计算出PEP、BE、EAE、WE及VC的EC50分别为15.697、3.577、7.803、30.246、1.379mg/mL。由此可知，以上各项萃取物对超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，清除力依次为BE＞EAE＞PEP＞WE。清除超氧阴离子自由基能力与总黄酮含量呈正相关，与VC相比，各相萃取物效果次于VC。可推测乳苣EAE和BE具有较好的清除超氧阴离子自由基作用，且发挥作用的成分主要在黄酮类提取部位。

2.3 乳苣不同溶剂萃取物对DPPH·的清除率

图3 不同溶剂提取物对DPPH·的清除率Fig.3 DPPH·scavenging rate of different solvent extracts

取乳苣不同提取溶剂浸膏，稀释至一定浓度，测定其DPPH·的能力，结果见图3。可知随样品质量浓度的增加，各相提取液对DPPH·的清除力增强，计算出PEP、BE、EAE、WE及VC的EC50分别为0.198、0.053、0.052、0.132、0.031mg/mL。由此可知，以上各项萃取物对DPPH自由基均有一定的清除作用，清除力顺序为EAE＞BE＞WE＞PEP。清除DPPH自由基能力与总黄酮含量呈正相关，与VC相比，各相萃取物效果次于VC。可推测乳苣EAE和BE具有较好的清除DPPH自由基作用，发挥作用的成分主要在黄酮类提取部位。

2.4 还原能力

图4 不同溶剂提取物的总还原能力Fig.4 Reduction abilities of different solvent extracts from Mulgedium tataricum L.

图4表明，样品及阳性对照的还原力强弱与溶液浓度呈正相关性，即同一样品提取物浓度越大，则吸光值越大，进而可知其还原力越大；且同一浓度不同样品线形越陡峭其还原力越大，由图4可知，还原力大小顺序为BE＞EAE＞WE＞PEP。

3 结论

3.1 以乳苣全草为原料，以75%乙醇为溶剂回流提取，提取液用不同极性溶剂依次萃取，分别得到PEP、EAE、BE和WE，同时测定各相提取物总黄酮依次为5.28%、15.02%、12.6%、9.39%。

3.2 测定各相萃取物清除羟自由基、超氧阴离子自由基、二苯代苦味肼基自由基（DPPH·），并与Vc进行比较，结果显示各相萃取物均具有一定的抗氧化活性，随着浓度的增加而提高；在不同的自由基产生体系中，EAE和BE均具有较好的清除作用，可推测发挥作用的成分主要在黄酮类提取部位。

[1]中国科学院中国植物志编写委员会.中国植物志第80卷（第一分册）[M].北京：科学出版社，1997：75.

[2]中国科学院中国植物编辑委员会.中国植物志[M].科学技术出版社，1997：75－76.

[3]江苏省植物研究所.新华本草纲目[M].第三册.上海科学技术出版社，1990：435.

[4]朱强，梁文裕，王俊.乳苣一新变种—白花乳苣[J].西北植物学报，2009，29（1）：195－196.

[5]Xiao Xiong WANG，Zhong Jian JIA.Two new lanostane－type triterpenoids from Mulgedium tataricum[J].Chinese Chemical Letters，2006，17（2）：204－206.

[6]Xiao Xiong WANG，Chang Jun LiIN，Zhong Jian JIA. Triterpenoids and sesquiterpenes from Mulgedium tataricum[J]. Planta Medica，2006，72（8）：764－767.

[7]高义霞，景红艳，姜祖君.响应面分析法优化乳苣总黄酮提取工艺的研究[J].中药材，2010，33（4）：621－624.

[8]谢贞建，焦士蓉，唐鹏程.枳实类黄酮体外抗氧化作用研究[J].林产化学与工业，2009，29（4）：33－36.

[9]张伟敏，肖健雄，符致坚，等.胆木叶提取物的抗氧化活性研究[J].林产化学与工业，2009，29（4）：82－86.

[10]张伟敏，符文英，李楠，等.诺丽叶化学成分与提取物抗氧化性质研究[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2009，35（5）：543－548.

Study on antioxidant activities of Mulgedium tataricum L. extraction using different solvents

GAO Yi-xia，ZHOU Xiang-jun，YANG Sheng，LIU Zhou-long，WANG Qiang-qiang（College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China）

Using Mulgedium tataricum L.with whole grass as raw material，75%ethanol extraction solvents，the resulting crude extracts were further extracted using different solvents respectively，such as petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol and water.And at the same time antioxidant activities of each phase were studied and compared with Vcusing hydroxyl radical system，superoxide radical system and system of DPPH.The results showed that all phases had certain antioxidant activities and the effect was increased with increase of concentration.Scavenging effect were as follows：ethyl acetate extracts＞n-butanol extracts＞Vc＞water extracts＞petroleum ether extracts for hydroxyl radical，Vc＞n-butanol extracts＞ethyl acetate extracts＞petroleum ether extracts＞water extracts for superoxide radical，Vc＞ethyl acetate extracts＞n-butanol extracts＞water extracts＞petroleum ether extracts for DPPH·and the reducing power were as follows：Vc＞n-butanol extracts＞ethyl acetate extracts＞water extracts＞petroleum ether extracts.

Mulgedium tataricum L.；effective components；antioxidation

TS255.1

A

1002－0306（2012）01－0085－03

2010－12－17

高义霞（1982－），女，助教，研究方向：资源植物学。

天水师范学院重点学科支持项目。