作物种子超低温保存方法的构建

赵跃平，燕平梅，邢 勇，张小冰，王小丽

（太原师范学院生物系，山西 太原 030031）

种质资源是人类极其珍贵的财富。随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良乃至农业可持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再生。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。

全世界拥有的作物种质资源96%以上是以种子形式保存的。温度是影响种子新陈代谢的主要因素之一，在低温状态下，种子细胞内代谢活动水平很低，物质和能量消耗少，细胞的衰老进程也很缓慢，因而可以长期保持种子生活力。国内外研究证明,利用液氮（-196℃）超低温冷冻技术可安全保存许多植物的种子、花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细胞等[1]。超低温冷冻保存一般以液态氮为冷源,使保存温度维持在-196℃。生物材料在如此低温下,新陈代谢活动基本停止,处于“生机停顿”（Suspanded animation）状态[2]。 这就有可能极大地延长储藏种子的寿命，而不产生遗传变异,从而有效地、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质[2]。利用液态氮保存植物种质,冷冻容器就是液氮罐，除了30～60天补充一次液氮外,不需要机械空调设备及其它管理,节省了大量的人力和物力，并且可以保持被保存组织及细胞培养物的遗传稳定性，是一种省时、省工、省费用的种质超低温保存新技术[3～5]。当解冻后，能够恢复再生能力。

种子的发芽率和活力指数是种子活力的重要指标之一[5，6]。冷冻方式和解冻方式是影响种子超低温贮藏效果最重要的两个因素。为此,本试验选用稀有作物豆类、麦类、粟类中的红小豆、荞麦、谷子为材料，测定经过不同的冷冻和解冻方法处理后对种子发芽率和生长势的影响,以构建植物种质资源超低温保存的最适方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红小豆、荞麦、谷子种子购于山西省左云、兴县和朔州地方种子站。

1.2 方法

1.2.1 冷冻和解冻方法

在中国农科院和山西农科院鉴定种子。将种子分成三组，用聚乙烯袋包装后冷冻：第一组种子直接投入液氮中保存；第二组种子经-20℃（1天）→-70℃（2天）→-196℃温度梯度冷冻；第三组经-70℃（2天）→-196℃温度梯度冷冻，三组保存在液氮中的种子，于保存30天后通过缓慢解冻（在18℃室温缓慢解冻）和快速解冻（在38℃水浴锅中解冻）两种方法解冻。

1.2.2 超低温保藏种子包装材料

红小豆、荞麦、谷子三种种子用聚乙烯袋、铝箔和牛皮纸袋包装后直接投入液氮中保存30天快速解冻后发芽计算发芽率和生长势。

1.2.3 超低温保藏种子的含水量

1.2.3.1 种子水分调节：在装有氧化钙的干操器中干操或在饱和水蒸汽下吸湿，将种子调整为5种含水量范围，分别为7% ～9%、12% ～14%、17% ～20%、30%～40%、40% ～50%。

1.2.3.2 含水量测定：整粒种子在105℃恒温下干操24 h，以湿重为基数计算含水最。

1.2.4 种子的发芽和发芽指标的测定

将解冻后的种子于25℃黑暗中经蒸馏水浸泡24 h后用蒸馏水冲洗数次，选取40粒饱满健状的种子，置于铺垫1层滤纸、2层纱布的培养皿中，置于25～30℃人工气候培养箱中作萌发试验，各作三次重复，逐日记录发芽数，并用蒸馏水冲洗补充水分。

测试种子的发芽率和生长势，计算公式参照陶嘉龄介绍的方法[7]：发芽率 =（3天内已发芽的种子数／全部种子数）×l00%；发芽指数（Gi）= ∑（Gt ／Dt）[式中：Gi为发芽指数 ∑为总和，Gt为在t日的发芽种子数，Dt为相应的发芽天数]；活力指数（VⅠ）=Gi×S[活力指数即生长势，S为一定时期（7天）内幼苗长度（cm），幼苗的长度度用直尺测定]。

1.3 数据的统计方法

试验原始数据的整理采用Excel软件完成，单因素差异显著性测验采用邓肯氏新复极差法完成，差异显著水平用0.01＜P＜0.05表示，差异极显著水平用P≤0.01表示。双因素方差分析采用S-N-K方法。

2 结果与分析

2.1 不同冷冻方式和解冻方式对种子发芽率和生长势的影响

2.1.1 不同冷冻方式和解冻方式对红小豆发芽率（%）的影响

由实验结果（见表1、表2）可知，预冻方式对红小豆种子超低温保存发芽率有显著影响。3个处理中，未经过预冻处理直接投入液氮保存的种子在快速解冻条件下，平均发芽率为100%，显著高于分别经过-70℃→-196℃温度梯度和-20℃→ -70℃→-196℃温度梯度冷冻两种预冻处理的种子发芽率 （P＜0.05）；未经过预冻处理直接投入液氮保存的种子在缓慢解冻条件下，平均发芽率为100%，显著高于分别经过-70℃→-196℃温度梯度和-20℃→-70℃→-196℃温度梯度两种预冻处理的种子发芽率 （P＜0.05）。在-70℃→ -196℃温度梯度与-20℃→ -70℃→ -196℃温度梯度的预冻条件下，快速解冻时平均发芽率只达到94.59%和94.12%，保存效果差，但两者之间未达到显著差异；在-70℃→-196℃温度梯度与-20℃→-70℃→-196℃温度梯度的预冻条件下，缓慢解冻时平均发芽率只达到94.12%和92.50%，保存效果差，两者之间也未达到显著差异。经过预冻处理的种子在保存后发芽率都有大幅度的下降。试验结果表明直接投入液氮方式较预冻方法 （温度梯度）发芽率高。

表1 不同冷冻方式和解冻方式对红小豆发芽率影响的多因素统计分析

表2 不同冷冻方式和解冻方式对红小豆发芽率（%）的影响

由表1、表2可知，解冻方式对红小豆种子的超低温保存发芽率无显著影响，直接投入液氮保存的种子在快速解冻和缓慢解冻的条件下发芽率均为100%；-70℃→-196℃温度梯度冷冻种子，在快速解冻即38℃温水浴条件下的平均发芽率与室温18℃自然化冻方式，未达到显著水平；-20℃→ -70℃→ -196℃温度梯度冷冻的种子，在快速解冻即38℃温水浴条件下的平均发芽率与室温18℃自然化冻方式，两者之间也未达到显著水平。研究结果表明，解冻方式对发芽率无显著影响。

由表1可知，冷冻方式和解冻方式交互作用：F=0.202、P=0.820＞0.05，接受无效假设，可以认为因素 a和因素b之间交互效应不显著，即冷冻方式与解冻方式间不存在交互效应。

2.1.2 不同冷冻方式和解冻方式对红小豆生长势的影响

由表3、表4可以看出，预冻方式对红小豆种子的超低温保存生长势有显著影响。三个处理中，未经过预冻处理直接投入液氮保存的种子在快速解冻条件下平均生长势为700.23，显著高于分别经过-70℃→-196℃温度梯度和-20℃→-70℃→-196℃温度梯度冷冻两种预冻处理的种子平均生长势 （P＜0.05）；未经过预冻处理直接投入液氮保存的种子在缓慢解冻条件下，平均生长势为618.39，显著高于分别经过-70℃→-196℃温度梯度和-20℃→-70℃→-196℃温度梯度冷冻两种预冻处理的种子平均生长势 （P＜0.05）。在-70℃→-196℃温度梯度与-20℃— → -70℃→-196℃温度梯度的预冻条件下，快速解冻时平均生长势分别为420.02、335.60，保存效果差，两者之间达到显著差异（P＜0.05）；在-70℃→ -196℃温度梯度与-20℃→-70℃→-196℃温度梯度的预冻条件下，缓慢解冻时平均生长势分别为343.26、279.02，保存效果差，两者之间也达到显著差异 （P＜0.05）。经过预冻处理的种子在保存后生长势都大幅度下降，且-20℃→-70℃→-196℃温度梯度的预冻种子生长势最低。试验结果表明，直接投入液氮方式较预冻方法（温度梯度）生长势高。

表3 不同冷冻方式和解冻方式对红小豆生长势影响的统计分析

表4 不同冷冻方式和解冻方式对红小豆生长势的影响

由表3、表4统计分析结果可知，解冻方式对红小豆种子的超低温保存生长势有显著影响。未经过预冻处理直接投入液氮保存的种子，在38℃温水浴条件下快速解冻的平均生长势高于室温18℃自然化冻方式，两者之间达到显著水平（P＜0.05）。-70℃ → -196℃温度梯度冷冻种子，在38℃温水浴条件下快速解冻的平均生长势高于室温18℃自然化冻方式，两者之间达到显著水平（P＜0.05）。-20℃ → -70℃ → -196℃温度梯度冷冻的种子，在38℃温水浴条件下快速解冻的平均生长势高于室温18℃自然化冻方式，两者之间达到显著水平（P＜0.05）。试验结果表明，快速解冻方式较自然化冻方法生长势高。

由表3可知，冷冻方式和解冻方式交互作用：F=0.167、P=0.848＞0.05，接受无效假设，可以认为因素 a和因素b之间交互效应不显著，即冷冻方式与解冻方式间不存在交互效应。

综上所述，超低温保存红小豆种子应选择未经过预冻处理直接投入液氮保存方法：解冻应采用快速解冻方法。

不同冷冻方式和解冻方式对荞麦和谷子种子发芽率和生长势的影响规律与对红小豆种子的影响规律类似，故相关试验数据从略。

2.2 不同包装材料对超低温保存种子发芽率和生长势的影响

三种包装材料对超低温保存红小豆种子发芽率和生长势的影响见表5，聚乙烯塑料袋和铝箔包装种子在液氮保存30天的发芽率显著高于用牛皮纸包装的；而聚乙烯塑料袋包装与铝箔包装种子的发芽率无显著差异。三种包装材料包装种子在液氮保存30天的发芽势无显著差异。试验结果说明，液氮保存种子使用聚乙烯塑料袋和铝箔包装材料好于牛皮纸包装。

荞麦和谷子种子在使用包装材料上和红小豆结果一样，即聚乙烯塑料袋和铝箔包装材料好于牛皮纸包装。

2.3 超低温保存种子含水量对发芽率和生长势的影响

表5 不同包装材料对超低温保存红小豆种子发芽率和生长势的影响

2.3.1 不同含水量对超低温保存红小豆种子发芽率和生长势的影响

由表6可知，含水量为7.89%、12.48%、18.77%、36.91%和40.12%的红小豆种子在液氮中保存30天后，发芽率差异显著（P＜0.05），发芽率从高到低的顺序为12.48%＞7.89%＞18.77%＞36.91%＞40.12%。12.48%含水量红小豆种子在液氮中保存30天后生长势显著高于其它四种含水量的种子；36.91%和40.12%含水量种子的生长势最低，两者无显著差异；7.89%和18.77%含水量种子的生长势次之，两者无显著差异。实验结果明，12.48%含水量（自然风干）的红小豆在液氮中保藏效果最好。

2.3.2 不同含水量对超低温保存荞麦种子发芽率和生长势的影响

由表7可知，含水量为7.21%、12.63%、17.59%、36.37%和40.29%的荞麦种子在液氮中保存30天后，发芽率和生长势差异显著 （P＜0.05），12.63%含水量种子的发芽率和生长势显著高于其它四种含水量 （P＜0.05）；7.21%含水量种子的发芽率和生长势显著高于17.59%、36.37%和 40.29%的含水量 （P＜0.05）；17.59%含水量种子的发芽率和生长势显著高于36.37%的含水量（P＜0.05）；与40.29%含水量种子的发芽率和生长势无显著差异。试验结果说明，12.63%含水量（自然风干）的荞麦种子在液氮中保藏效果最好。

表7 不同含水量对超低温保存荞麦种子发芽率和生长势的影响

2.3.3 不同含水量对超低温保存谷子种子发芽率和生长势的影响

由表8可知，含水量为7.39%、13.15%、18.16%、36.68%和40.59%的谷子种子在液氮中保存30天后发芽率和生长势差异类同，13.15%含水量种子的发芽率和生长势显著高于其它四种含水量 （P＜0.05），18.16%含水量种子的发芽率和生长势显著高于7.39%、36.68%和40.59%的含水量（P＜0.05）；后三者含水量种子的发芽率和生长势无显著差异。试验结果说明，13.15%含水量（自然风干）的谷子种子在液氮中保藏效果最好。

表8 不同含水量对超低温保存谷子种子发芽率和生长势的影响

从三种农作物（红小豆、荞麦和谷子）种子的7%～9%、12% ～14%、17% ～20%、30% ～40%、40% ～50%五个含水量的发芽试验结果可知，12%～14%含水量（自然风干）范围适合液氮保存。

3 讨论

本试验对预冷和直接在液氮中的冷冻方法和解冻方法对种子生活力的影响进行了初步研究，观察到经过快速冷冻和快速解冻处理的种子效果最好。

细胞结构的完整性是种子活力的基础[8]。将植物种子直接投入液氮中保存，降温速度极快，种子内的水分在降温冷冻过程中，从-10℃～-140℃范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到-140℃时完全停止增长，利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，不能形成致死的冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。快速冷冻是一种以快速通过冰晶生长危险温度区使种子进入玻璃化[4]，从而减小细胞伤害的有效途径。而预冷的种子降温速度慢，不能越过危险温度区，冰晶形成并增长，破坏细胞结构。因此，快速冷冻效果最佳。

超低温保存中，冰冻伤害有时在冰冻过程中不发生，但在解冻过程中发生[9]。-5～-10℃是再结冰的温度区，缓慢解冻时，细胞内易发生剧烈再结晶和冰晶体增大，使细胞死亡；快速解冻能使其通过危险温度区而防止解冻过程中再结晶，冰晶体增大，对细胞无损伤，细胞膜不涨裂，种子仍有较高活力；缓慢解冻的种子破坏细胞结构，细胞膜受到损伤，修复能力减弱，种子活力降低。解冻速度是解冻技术的关键。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶而导致细胞死亡；解冻速度快来不及再结晶，细胞存活，所以快速解冻优于缓慢解冻。

植物种子液氮保存时都有一个适宜的含水量范围。液氮保存并非含水量越低越好，含水量降到一定极限则产生脱水损伤，导致种子发芽能力伤失[9]。本试验探究不同含水量对液氮保存种子发芽率的影响，结果显示，低含水量（7%～9%）的种子保存在液氮中的发芽率低于自然风干种子（12%～14%）的发芽率。

由本实验研究结果可知，快速冷冻和快速解冻处理的种子效果最好，低含水量（7%～9%）的种子保存在液氮中的发芽率低于自然风干种子 （12%～14%）的发芽率；采用不同包装材料包装红小豆、荞麦和谷子种子于液氮保存测定发芽率和生长势，结果显示聚乙烯塑料袋和铝箔包装材料好于牛皮纸包装。

参考资料：

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