虫草素改善脑缺血小鼠学习记忆及对海马神经元数量的影响

蔡昭林， 李楚华， 王晓琦， 蒋中娇， 郑 月， 李海航， 肖 鹏

(华南师范大学生命科学学院，广东广州 510631)

虫草素改善脑缺血小鼠学习记忆及对海马神经元数量的影响

蔡昭林， 李楚华， 王晓琦， 蒋中娇， 郑 月， 李海航， 肖 鹏*

(华南师范大学生命科学学院，广东广州 510631)

采用双侧颈动脉夹闭建立脑缺血模型，观察造模后和造模前腹腔注射100 mg/kg虫草素对小鼠Y迷宫行为训练的影响，以及检测海马各区神经元数量的变化.结果表明，造模前给予虫草素能明显提高小鼠的正确反应率(P<0.05)，减少达标所需训练次数(P<0.05)，显著增加海马CA1区和CA3区锥体神经元数量(P<0.01).造模后给予虫草素显著减少小鼠达标所需训练次数(P<0.05)；同时，海马CA3区神经元数量显著增加(P<0.01).由此可见，虫草素能改善脑缺血小鼠的学习能力，预防作用比治疗作用更为显著，可能与虫草素促进海马神经元的修复有关.

虫草素; 脑缺血; 小鼠; 学习记忆; 海马神经元

虫草素(cordycepin)，又称3′-脱氧腺苷(3′-deoxyadenosine)，为天然中药材冬虫夏草的活性成分之一，分子式为C10H13N5O3，结构式见图1[1].研究表明，虫草素能防止缺血引起的海马CA1区锥体神经元损伤[2]，改善Aβ淀粉样蛋白诱导的学习记忆障碍[3]，并提高东莨菪碱诱导的障碍模型小鼠的学习记忆能力[4].本研究室前期研究表明[5]，虫草素下调神经元的活动，有助于改善缺血或其他兴奋性毒性病症.脑缺血性损伤情况下，虫草素对海马依赖的学习记忆产生影响尚未见报道.本研究将探讨虫草素对脑缺血动物学习记忆的作用，及其对海马各区神经元数量的影响，为虫草素在神经系统的开发和应用提供实验依据.

图1 虫草素结构式

1 材料与方法

1.1实验动物

三月龄健康雄性昆明种小鼠48只，体质量22±2 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2008-0020.饲养环境温度25±1 ℃，自然光照，给予充足的饮水和食物，适应3 d后开始实验.

1.2主要药品与仪器

虫草素由华南师大生科院植物化学研究室提供，3′-脱氧腺苷纯度≥98%[6]，虫草素粉末溶于无菌生理盐水，配制为4 mg/mL的溶液；MG-B型三等分辐射式迷宫，购自江苏张家港市三兴教学器械厂；HM340E石蜡切片机和HMS740全自动染色机，购自德国美康公司；BX51TF光学显微镜，购自日本奥林巴斯公司.

1.3动物模型的建立

双侧颈动脉夹闭方法建立脑缺血动物模型[2,7]，操作如下：0.7%巴比妥钠0.1 mL/20 g麻醉，仰卧固定，取正中切口，分离并夹闭双侧颈总动脉15 min.假手术小鼠仅剥离双侧颈总动脉，不夹闭.

1.4动物分组与给药

本实验由造模后给药和造模前给药2部分内容组成.

第一部分：假手术组Ⅰ、模型组Ⅰ和药物组Ⅰ，n=8，造模后3 d开始给药，腹腔注射，虫草素的剂量为100 mg/kg，假手术组和模型组注射等量的生理盐水，连续9 d.

第二部分：假手术组Ⅱ、模型组 Ⅱ和药物组Ⅱ，n=8，造模前7 d开始给药，腹腔注射，虫草素的剂量为100 mg/kg，假手术组和模型组注射等量的生理盐水，连续18 d.

1.5行为学训练

训练模型为三等分辐射式迷宫箱.检测指标为每实验日正确反应率及达到学会标准所需的训练次数.小鼠受电击后从起步区直接到达安全区为“正确反应”，反之为“错误反应”.造模后第5天开始迷宫训练，连续7 d，每天训练20次，2次训练间隔时间为20～30 s.当正确反应率≥90%时，动物达学会标准(达标).电击强度为30～50 V，所有训练均在晚间无光的安静环境中进行.

1.6组织切片与观察

石蜡切片和HE染色方法.行为学训练结束后，小鼠断头取脑，置于体积分数为4%多聚甲醛溶液中固定过夜，依次脱水，浸蜡，包埋，制作石蜡切片，切片厚度为4 μm，运用HMS740全自动染色机进行HE染色.利用光学显微镜于20倍物镜分别拍摄CA1、CA3和DG区，选取各区中部5 000 μm2范围，统计神经元数量.

1.7统计学方法

2 结果与分析

2.1虫草素对脑缺血小鼠迷宫学习的影响

2.1.1 造模后给予虫草素对脑缺血小鼠学习能力的影响 模型组第2、第3和第5天的脑缺血小鼠正确反应率分别为55.0%±8.5%、71.3%±13.6%和86.3%±9.9%(表1)，显著低于假手术组的69.4%±10.4%、82.2%±9.7%和95.6%±5.8%(P<0.05).模型组的达标所需训练次数为(120.0±17.8)，显著高于假手术组(77.5±22.5)(P<0.01).与模型组比较，药物组每天正确反应率虽不具显著性差异(P>0.05)，但达标所需训练次数(100.0±20.0)显著减少(P<0.05)(图2).

脑缺血小鼠学习记忆能力降低，给予虫草素处理后，正确反应率虽无显著性变化，但达标所需训练次数显著减少，提示虫草素对缺血所致的学习记忆障碍具有一定的治疗作用.考虑到造模后给药周期较短，且虫草素作为保健品，主要用于疾病预防[2]，因此设置了造模前给药实验，探讨虫草素对脑缺血所致学习记忆障碍的预防作用.

表1 造模后给予虫草素脑缺血小鼠的正确反应率

注：与假手术组相比，*为P<0.05，**为P<0.01；与模型组对比，#为P<0.05，##为P<0.01(下同).

图2 造模后给予虫草素脑缺血小鼠达标所需的训练次数(n=8)

2.1.2 造模前给予虫草素对脑缺血小鼠迷宫学习的影响 表2和图3所示，模型组每天正确反应率均低于假手术组，达标所需训练次数(132.5±26.0)也显著高于假手术组(92.5±21.2)(P<0.01).药物组每天正确反应率从第2天开始均高于模型组，其中第3、第4、第5和第7天分别为80.7%±10.6%、92.9%±7.0%、92.1%±9.1%和97.1%±5.7%，显著高于模型组的70.6%±7.8%、71.9%±16.5%、80.6%±10.5%和88.8%±7.4%(P<0.05)；达标所需训练次数为(105.0±32.1)，显著低于模型组(P<0.05).

表2 造模前给予虫草素对脑缺血小鼠的正确反应率

图3 造模前给予虫草素对脑缺血小鼠达标所需训练次数(n=8)

造模前给予虫草素能够显著提高脑缺血小鼠的正确反应率和达标所需训练次数，对缺血性损伤诱发的学习记忆障碍具有显著的预防作用.

2.2虫草素对脑缺血小鼠海马神经元的影响

2.2.1 造模后给予虫草素对脑缺血小鼠海马神经元的影响 与假手术组比较，模型组小鼠海马CA1区神经元数密度显著降低(P<0.05)(表3)，而CA3区和DG区的神经元数量均没有显著性的变化(P>0.05)；与模型组比较，造模后给予虫草素处理，小鼠海马CA1区和DG区神经元数量没有显著变化(P>0.05)，而CA3区显著增加(P<0.01)(图4).实验结果表明，脑缺血引起海马CA1区锥体神经元减少，造模后给予虫草素对脑缺血小鼠海马CA1区锥体神经元数量没有明显的影响，而CA3区锥体神经元的数量则显著增加.

表3 造模后给予虫草素对脑缺血小鼠海马各区神经元数密度的影响

2.2.2 造模前给予低浓度虫草素对脑缺血小鼠海马神经元的影响 模型组CA1区神经元数密度显著低于假手术组(P<0.01)，造模前给予虫草素，CA1区和CA3区神经元数量显著提高(P<0.01)(表4)；而DG区神经元数量虽无显著性的变化，但显示出脑缺血后神经元数密度减低的趋势，提前给予虫草素处理却使神经元数量有所提升(P>0.05)(图5).结果表明，造模前给予虫草素能改善CA1区锥体神经元的缺血性损伤，CA3区锥体神经元的数量亦显著增加.

表4 造模前给予虫草素对脑缺血小鼠海马各区神经元计数

a:假手术组; b:模型组; c:药物组; 矩形框:统计区域

3 讨论

3.1虫草素对脑缺血小鼠学习记忆的影响

脑缺血引发动物大脑海马组织脂质过氧化损伤和学习记忆障碍[8].虫草素对脑缺血动物行为学的研究尚未见报道，有文献报道虫草素对Aβ淀粉样蛋白诱导的大鼠学习障碍[3]和东莨菪碱诱导的小鼠记忆获得障碍[4]均有改善作用.另外，LIU等报道[9]，冬虫夏草提取物可提高脑缺血大鼠神经行为.本研究造模后3 d和造模前7 d给予100 mg/kg虫草素均能改善小鼠缺血性损伤引发的迷宫学习障碍，并以造模前给药的作用更为有效.动物的行为习得依赖于大脑海马结构[10]，学习障碍的改善与脑区结构的修复是否存在相关性？作者在行为学的基础上，进一步研究虫草素对缺血小鼠海马CA1、CA3和DG区神经元数量的影响.

3.2虫草素对脑缺血小鼠海马神经元的影响

海马结构中的CA1、CA3和DG区，在学习与记忆中均具有重要作用[11].脑缺血对海马各亚区的影响有所不同，CA1区锥体神经元对缺血损伤较为敏感，而CA3区和DG区则具有较强的抗损伤能力[12].本研究发现，造模前给予虫草素能够显著提高脑缺血小鼠海马CA1区锥体神经元数量，而造模后给药效果不显著.另外，海马CA3区神经元突触结构的改善与学习记忆的提高密切相关[13].脑缺血并未显著改变CA3神经元的密度，而虫草素处理则可显著增加神经元的数量.其机理有待深入研究.

LI等报道[14]，脑缺血诱发脑室和下颗粒层的神经干细胞(stem cells)和祖细胞(progenitor cells)增殖，进而弥补海马CA1区和CA3区锥体神经元的损伤.另外，蛋白激酶C参与了缺血损伤过程中海马CA1区锥体神经元的修复[15].本研究室研究表明[5]，虫草素可降低CA1区锥体神经元的发放频率，并使细胞膜电位趋于超极化，提示虫草素能降低神经元的活动，可能有助于改善缺血或其他兴奋性毒性病症.虫草素调节神经元的活动，是否与蛋白激酶C或神经干细胞/祖细胞相关，从而发挥神经保护作用，需要进一步的探索.

综上所述，虫草素能改善脑缺血引起的学习记忆障碍，以预防作用更为显著.其机制可能与虫草素促进海马锥体神经元缺血性损伤的修复有关.

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PromotionofBehavior-LearningandEffectonNumberofHippocampalNeuronsofMiceInjuredbyIschemiawithCordycepinTreatment

CAI Zhaolin, LI Chuhua, WANG Xiaoqi, JIANG Zhongjiao, ZHENG Yue, LI Haihang, XIAO Peng*
(School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

To investigate effects of cordycepin on learning and hippocampal neurons of mice injured by ischemia, we processed ischemic mice model by 2-vessel occlusion, and observed Y maze training of mice with post- or pre-treatment of 100 mg/kg cordycepin (i.p.), which was followed by the detection of hippocampal neurons density in CA1, CA3and DG region. The results indicated that pre-treatment of cordycepin increased rates of correct responses (RCR) and decreased trails of reaching standard (TRS) significantly (P<0.05), with an increased number of hippocampal pyramidal neurons both in CA1and CA3region (P<0.01). On the other hand, post-treatment of cordycepin remarkably reduced TRS (P<0.05) without distinguished changes of RCR (P>0.05) and only improved the number of pyramidal neurons in hippocampal CA3region (P<0.01). Together, we concluded that cordycepin conspicuously ameliorated behavioral learning of mice injured by ischemia, which was more effective with pre-treatment, possibly attributing to restoration of hippocampal neurons with cordycepin application.

2011-10-17

国家自然科学基金项目(39300039)

*通讯作者,xiaopeng@scnu.edu.cn.

1000-5463(2012)03-0095-05

Q427

A

10.6054/j.jscnun.2012.06.021

Keywords： cordycepin; ischemia; mice; behavior-leaning; hippocampal neurons

【责任编辑 成 文】